Pendahuluan
Senyawa amina aromatik primer tidak tersulfonasi merupakan cemaran bahan baku zat warna yang bersifat karsinogenik. Oleh sebab itu, Codex Alimentarius Committe (CAC) membatasi jumlahnya dalam bahan baku zat warna sebesar 0,01% dihitung sebagai anilina. Anilina dapat dianalisa secara spektrofotometri setelah mengalami reaksi diazotisasi dan kopling dengan suatu senyawa fenol atau senyawa amina aromatik lainnya.
Pada metode yang telah ditetapkan oleh JECFA (2006), amina aromatik primer tidak tersulfonasi diekstraksi menggunakan toluen dari sampel yang bersifat basa, kemudian diekstraksi kembali dalam asam, dan ditentukan secara spektrofotometri setelah dilakukan reaksi diazotisasi dengan menggunakan pereaksi asam nitrit dan reaksi kopling dengan menggunakan pereaksi garam dinatrium 2- naftol-3,6 disulfonat (JECFA 2006).
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan metode penentuan senyawa amina aromatik primer tidak tersulfonasi dihitung sebagai anilina dalam bahan baku zat warna tartrazin secara spektrofotometri ultraviolet-sinar tampak dengan menggunakan senyawa 2-naftol sebagai pereaksi pengkopling. Senyawa 2-naftol adalah senyawa fenol yang secara struktur mirip dengan 2-naftol-3,6-disulfonat, sehingga secara teoritis dapat bereaksi dengan anilina dalam kondisi yang distandarkan.
Percobaan
Bahan
Aniline-Pestanal (Sigma Aldrich), tartrazin (food grade), toluene p.a (Merck), asam hidroklorat, kalium bromida p.a (Merck), natrium karbonat (Merck), natrium hidroksida (Merck), natrium nitrit (Merck), 2-Naftol (Merck), urea, aquadest.
Alat
Spektrofotometer Ultraviolet – Visibel (Beckman DU-600), kuvet, pH meter (Mettler Toledo), timbangan analitik (Mettler Toledo AG104), termometer, serta alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium kimia.
Penyiapan Larutan Pereaksi
Dilakukan penyiapan larutan pereaksi berupa larutan asam hidroklorat 3N, larutan asam hidroklorat 1 N, larutan kalium bromida 50%, larutan natrium karbonat 2N, larutan natrium hidroksida 1N, larutan
natrium hidroksida 0,1N, larutan urea 1%, larutan 2 naftol 0,05N, dan larutan natrium nitrit 0,5 N.
Penyiapan Larutan Baku Pembanding
Baku pembanding anilina ditimbang sebanyak 0,01 g dalam Beaker glass kecil, kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL, dan Beaker glass dibilas secara berulang dengan air. Pada suhu ruangan, sebanyak 30 mL asam hidroklorat 3 N ditambahkan kemudian digenapkan dengan air hingga 100 mL. Kemudian sebanyak 10 mL larutan tersebut dipipet ke dalam labu takar 100 mL dan digenapkan dengan air. Diperoleh konsentrasi akhir larutan sebesar 0,1 mg/mL (100 ppm). Larutan baku pembanding ini harus selalu dibuat segar.
Penetapan Panjang Gelombang Maksimum
Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 1 mL larutan baku pembanding anilina 100 ppm dan 9 mL asam hidroklorida 1 N diaduk dan dibiarkan selama 5 menit dalam Beaker glass yang berisi es/air es dan suhu dipertahankan di bawah 5oC. Kemudian sebanyak 1 mL larutan kalium bromida 50% dan 0,05 mL larutan natrium nitrit 0,5 N ditambahkan, diaduk dan disimpan kembali dalam Beaker glass yang berisi es/air es yang dipertahankan suhunya di bawah 5°C selama 10 menit sehingga terjadi reaksi diazotisasi. Setelah itu ke dalam tabung reaksi tersebut ditambahkan 5 mL urea 1% dan dibiarkan kembali selama 10 menit. Kemudian ke dalam labu takar 25 mL ditambahkan 1 mL larutan 2-Naftol 0,05 N dan 4 mL larutan Na2CO3 2 N. Kemudian ke dalam labu takar tersebut dituangkan larutan anilina yang telah mengalami reaksi diazotisasi secara perlahan-lahan dan digenapkan dengan aquadest hingga batas dan ditutup. Setelah labu ukur tertutup tersebut diaduk dengan baik dan disimpan selama 5 menit, dilakukan penelusuran absorbansi pada panjang gelombang antara 450-650 nm dengan menggunakan kuvet 40 mm.
Sebagai larutan pembanding digunakan campuran 10 mL asam hidroklorat 1 N, 5 mL larutan urea 1%, 4 mL larutan Na2CO3 2 N, dan 1 mL larutan 2-naftol dalam labu takar 25 mL yang kemudian digenapkan dengan air hingga batas.
Penyiapan Grafik/Kurva Kalibrasi
Ke dalam lima labu ukur 100 mL yang berbeda dimasukkan masing-masing larutan baku pembanding sebanyak 5; 10; 12,5; 15; 20; dan 25 mL. Setiap labu ukur digenapkan dengan asam hidroklorat 1 N hingga tanda.
Sebanyak 10 mL larutan dari setiap labu ukur diambil dan ditempatkan dalam tabung reaksi bersih dan kering yang berbeda. Kemudian kelima tabung reaksi didinginkan dalam Beaker glass berisi es suhu dijaga kurang dari 5°C.
Ke dalam tiap tabung ditambahkan 1 mL larutan kalium bromida 50% dan 0,05 mL larutan natrium nitrit 0,5 N, diaduk dan dibiarkan selama 10 menit sehingga terjadi reaksi diazotisasi. Kemudian ditambahkan sebanyak 5 mL urea 1% diaduk dan didiamkan selama 10 menit.
Ke dalam lima labu ukur 25 mL ditambahkan 1 mL larutan 2-naftol dan 4 mL natrium karbonat. Ke dalam setiap labu ukur 25 mL yang telah berisi larutan 2 naftol dan natrium karbonat tersebut dimasukkan larutan anilina yang sudah mengalami diazotisasi, tabung reaksi yang semula berisi larutan anilina dibilas dengan tetesan-tetesan air, setelah itu labu ukur digenapkan dengan menggunakan air hingga batas 25 mL dan ditutup. Setelah labu ukur tertutup tersebut diaduk dengan baik dan disimpan selama 5 menit kemudian dilakukan pengukuran absorbansi larutan secara duplo pada panjang gelombang 540 nm dengan menggunakan kuvet 40 mm.
Sebagai larutan pembanding digunakan campuran 5 mL asam hidroklorat 1 N, 4 mL larutan natrium karbonat, 5 mL larutan urea 1% dan 1 mL larutan 2 naftol, yang diencerkan dengan menggunakan air hingga diperoleh volume akhir sebanyak 25 mL.
Grafik diperoleh dengan memplot hubungan antara absorbansi dengan bobot anilina dalam 25 mL larutan anilina. Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien determinasi (r2 ) dan koefisien variansi fungsi regresi pada analisis regresi linier Y=bX + a (Harmita 2004).
Berdasarkan kurva kalibrasi yang diperoleh, dilakukan perhitungan dan uji kaji statistik meliputi linieritas, batas deteksi, dan batas kuantisasi menggunakan metode yang digunakan oleh Gottwald (2000).
Penentuan Keseksamaan
Menggunakan metode "spike"/ penambahan baku, masing-masing sejumlah volume tertentu larutan baku pembanding yang setara dengan konsentrasi akhir anilina pada larutan uji 0,8 µg/mL, ditambahkan ke dalam 2 g sampel bahan baku pewarna uji diberikan perlakuan sebagaimana penyiapan dan evaluasi larutan uji dengan enam replikasi dan diukur absorbansinya pada λ 540 nm. Untuk penentuan keseksamaan dihitung rataan, simpangan baku dan koefisien variansi dari rataan (Harmita 2004).
Penentuan Kecermatan
Menggunakan metode "spike" (penambahan baku), masing-masing sejumlah volume tertentu larutan baku pembanding yang setara dengan konsentrasi akhir anilina pada larutan uji sebesar 0,6; 0,8; dan 0,9 µg/mL, ditambahkan ke dalam 2 g sampel bahan baku pewarna uji diberikan perlakuan sebagaimana penyiapan dan evaluasi larutan ujidengan masingmasing tiga replikasi dan diukur absorbansinya pada λ 540 nm. Untuk penentuan kecermatan dihitung persen perolehan kembali (Harmita 2004).
Penyiapan dan Evaluasi Larutan Uji
Sebanyak 2 g sampel bahan baku pewarna dimasukkan ke dalam corong pisah yang berisi 100 mL air, kemudian dinding corong pisah dibasuh dengan 50 mL air, setelah itu dikocok untuk melarutkan sampel dan ditambahkan larutan NaOH 1 N sebanyak 10 mL.
Larutan pewarna diekstraksi dengan menggunakan 25 mL toluen sebanyak empat kali, kemudian fraksi toluen digabungkan dan dibilas dengan 10 mL larutan NaOH 0,1 N untuk membasuh zat warna yang tersisa.
Ekstrak fraksi toluen yang diperoleh kemudian dibilas dengan 10 mL larutan asam hidroklorat 3 N sebanyak tiga kali kemudian ekstrak diencerkan dengan menggunakan air hingga 100 mL dan diaduk dengan baik. Larutan yang dihasilkan disebut dengan larutan U.
Sebanyak 10 mL larutan U dipipet kedalam tabung yang bersih dan kering, setelah itu didinginkan dalam Beaker glass berisi es selama 10 menit. Ke dalam Beaker glass yang telah didinginkan ditambahkan 1 mL larutan KBr dan diperlakukan sebagaimana penyiapan untuk pembuatan kurva kalibrasi, dimulai dengan penambahan 0,05 mL larutan natrium nitrit.
Absorbansi larutan uji diukur secara duplo pada panjang gelombang 540 nm menggunakan kuvet 40 mm, dengan menggunakan blanko yang dibuat dari 10 mL larutan U, 5mL larutan urea 1%, 4 mL larutan natrium karbonat 2 N dan 1 mL larutan 2-naftol 0,05 N yang diencerkan dengan air hingga 25 mL. Berdasarkan grafik kalibrasi akan diperoleh bobot anilina dari hasil pengamatan absorbansi larutan uji.
Hasil dan Pembahasan
Senyawa anilina merupakan suatu senyawa amina primer (R-NH2) yang dapat mengalami reaksi diazotisasi dan kemudian digabung dengan pereaksi 2-naftol membentuk suatu senyawa berwarna yang menyerap radiasi di daerah sinar tampak. Diazotisasi adalah pembentukan garam diazonium melalui reaksi amina aromatik dengan asam nitrit. Pada penelitian ini anilina dilarutkan dalam HCl dan direaksikan dengan asam nitrit menghasilkan benzendiazonium klorida. Asam nitrit dihasilkan secara in situ melalui reaksi natrium nitrit (Na+ ONO) dengan HCl. Garam diazonium yang terbentuk sangat reaktif, oleh karena itu campuran reaksi harus didinginkan (Fessenden dan Fessenden 1994). Reaksi yang terjadi diawali dengan reaksi nitrosasi amina dilanjutkan dengan tautomerisasi dari nitrosamina yang terbentuk dan diakhiri dengan dekomposisi senyawa diazohidroksida menjadi garam diazonium (Connors 1975).
\[NaNO_{2} + HCI \longrightarrow HNO_{2} + NaCI\] \[NaNO_{2} + HCI \longrightarrow HNO_{2} + NaCI\] \[Nh_{6} + HNO_{2} \xrightarrow{KBr} \longrightarrow NH-N=0 + H_{2}O\] \[NH-N=0 \longrightarrow N-CH\] \[N=N-CH + HCI \longrightarrow N=N\] \[+ H_{2}O\]
Gambar 1. Pembentukan garam benzendiazonium klorida.
Garam diazonium yang stabil dalam suasana asam dan suhu terkendali di bawah 5°C, kemudian digabung dengan senyawa 2-naftol yang sebelumnya telah dilarutkan dalam natrium hidroksida. Dalam kondisi optimum reaksi kopling akan terjadi melalui suatu mekanisme substitusi elektrofilik aromatik pada posisi ortho, melalui reaksi sebagai berikut:
Gambar 2. Reaksi kopling garam benzendiazonium klorida dengan 2- naftol.
Kelebihan asam nitrit (HNO<sub>2</sub>), yang dalam larutan asam akan membentuk kation nitrosonium (NO<sup>+</sup>) (Connors 1975), dapat mengganggu pembentukan zat warna yang dihasilkan. Hal tersebut dapat mengakibatkan peningkatan absorbansi secara terus menerus sehingga metode ini tidak dapat digunakan
dalam analisis secara kuantitatif. Pengaruh penambahan urea dapat dilihat pada Gambar 3.
Kelebihan asam nitrit dapat dihilangkan dengan penambahan urea (CO(NH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>) (De Almeida-Filho 1983; Susanty 2011). Adapun reaksi yang terjadi dapat dijelaskan dalam persamaan reaksi sebagai herikut
\[2 HNO_2 + CO(NH_2)_2 \rightarrow CO_2 + 2 N_2 + 3 H_2O\]
Gambar 3. Pengaruh penambahan urea terhadap absorbansi (a) sebelum dan (b) setelah penambahan urea.
Dilakukan penelusuran panjang gelombang absorbansi pada suasana basa, dan diperoleh absorbansi maksimum pada panjang gelombang 540 nm. Hal tersebut ditunjukkan pada Gambar 4.
Berdasarkan hasil optimisasi, nampak bahwa pada pH 9 reaksi pembentukan warna berjalan optimum. Hal tersebut ditunjukkan dengan nilai aborbansi yang tinggi sebesar 0,7606 dan laju penurunan absorbansi yang rendah yaitu sebesar 0,0017 dA/min. Hal ini terjadi karena 2-naftol (pKa 9,5) akan mengalami ionisasi pada suasana basa. Pada penelitian ini 2-naftol dilarutkan dalam larutan NaOH, sehingga gugus hidroksida pada 2-naftol yang terionisasi
membentuk suatu fenolat (fenoksida). Atom oksigen bersifat menarik elektron karena keelektronegatifannya yang lebih tinggi dibandingkan dengan atom karbon.
Gambar 4. Spektrum sinar tampak dari senyawa hasil reaksi penggabungan.
Hal tersebut menyebabkan terjadinya efek induksi negatif (-I effect) dan terjadinya efek mesomerik negatif (-M effect) pada suatu senyawa asam aromatik. Hal ini menyebabkan delokalisasi elektron sehingga memungkinkan terjadinya reaksi substitusi elektrofolik aromatik antara garam benzendiazonium klorida dan 2-naftol pada posisi ortho. Efek mesomerik atau resonansi yang terjadi dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Resonansi elektron pada senyawa 2-naftol yang terionkan.
Namun, pada suasana sangat basa garam diazonium yang sangat tidak stabil akan melepaskan gugus \(N_2\) (merupakan gugus pergi yang baik) dengan adanya suatu nukleofil (Nu¹) misalnya hidroksida (OH¹) sehingga reaksi kopling tidak akan terjadi (Fessenden dan Fessenden 1994). Perbandingan pengaruh pH terhadap absorbansi dan laju penurunan absorbansi dapat dilihat pada Tabel 1 dan Gambar 7.
Gambar 6. Lepasnya gugus N<sub>2</sub> dengan adanya suatu nukleofilik.
Tabel 1. Perbandingan Pengaruh pH terhadap Absorbansi dan Laju Penurunan Absorbansi
| Kadar Anilina (μg/ml) | pН | Absorbansi (λ 540 nm) | dA/min | |
|---|---|---|---|---|
| 8 | 7 | 0,3144 | 0006 | |
| 8 | 8 | 0,4752 | -0,0009 | |
| 8 | 9 | 0,7606 | -0,0017 | |
| 8 | 9,5 | 0,9723 | -0,0109 | |
| 8 | 10 | - | terbentuk endapan | |
Kurva kalibrasi linier hasil pengukuran larutan baku anilina pada konsentrasi 2-10 µg/ml dapat dilihat pada Gambar 8, sedangkan perhitungan berbagai parameter uji linieritas dan kuadratik kurva kalibrasi dapat dilihat pada Tabel 3 dan Tabel 4.
Tabel 2. Hasil Pengukuran Absorbansi Larutan Baku Anilina yang Telah Direaksikan
| C (µg/ml) | Absorbansi pada λ 540 nm | |||
|---|---|---|---|---|
| 2 | 0,1912 | |||
| 4 | 0,3833 | |||
| 5 | 0,4758 | |||
| 6 | 0,5623 | |||
| 8 | 0,7661 | |||
| 10 | 0,9523 | |||
Gambar 7. Kurva kalibrasi hasil reaksi larutan baku anilina pada λ 540 nm.
Tabel 3. Parameter Pengujian Linieritas Kurva Kalibrasi
| Parameter | Nilai |
|---|---|
| Pers. regresi linier | Y = 0,0952x - 0,0005 |
| b | 0,0952 |
| a | -0,0005 |
| X rata-rata | 5,8333 |
| Sy/x | 0,0052 |
| (Sy/x)/b | 0,0541 |
| Vx0(%) | 0,9274 |
| r | 0,9998 |
| BD (μg/mL) | 0,1623 |
| BK (μg/mL) | 0,5410 |
Berdasarkan perbandingan hasil pengujian Vxo terhadap persamaan garis regresi linier dan kuadratik yang diperoleh dengan menggunakan metode Gottwald, dapat disimpulkan bahwa kurva kalibrasi
tersebut lebih mendekati model linier dibandingkan model kuadratik.
Tabel 4. Parameter Pengujian Kuadratik Kurva Kalibrasi
| Parameter | Nilai |
|---|---|
| Pers. Kuadratik | Y = 1,97.10-4 x 2 + 9,29.10-2 x |
| – 5,45.10-3 | |
| X rata-rata | 5,8333 |
| E (sensitivitas) | 0,0952 |
| Sy/x | 0,0057 |
| (Sy/x)/b | 0,0594 |
| Vx0(%) | 1,0191 |
Diperoleh persamaan regresi linier y = 0,0952x - 0,0005 dengan nilai koefisien determinasi (r2 ) sebesar 0,9997 pada rentang 2-10 μg/mL, dengan nilai koefisen korelasi regresi (r) sebesar 0,9998 yang
Tabel 5. Persentase Perolehan Kembali
| Kadar Anilina (μg/ml) | Absorbansi Hasil Pengukuran | Kadar Anilina Terukur | Rataan Kadar Anilina Terukur (Cu) | Rataan Kadar Anilina Sampel (Cs) | Cu-Cs | Rataan Persentase Perolehan kembali (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0,0501 | 0,5315 | |||||
| 0,6 | 0,0499 | 0,5294 | 0,5266 | 0,0302 | 0,4964 | 82,74 |
| 0,0489 | 0,5189 | |||||
| 0,0674 | 0,7132 | |||||
| 0,8 | 0,0696 | 0,7363 | 0,7237 | 0,0302 | 0,6935 | 86,69 |
| 0,0682 | 0,7216 | |||||
| 0,074 | 0,7826 | |||||
| 0,9 | 0,0754 | 0,7973 | 0,8004 | 0,0302 | 0,7702 | 85,58 |
| 0,0777 | 0,8214 |
lebih tinggi dari persyaratan, yaitu ≥0,98 dan koefisien variansi regresi (Vx0) yang diperoleh sebesar 0,9274 lebih rendah dari yang dipersyaratkan yaitu < 5,0. Adapun batas deteksi sebesar 0,1623 μg/mL menunjukkan bahwa metode analisa dapat digunakan untuk menentukan uji batas secara kualitatif pada kadar yang sama atau lebih besar dari kadar tersebut, sedangkan batas kuantisasi sebesar 0,5410 μg/mL menunjukkan kadar cemaran terkecil yang mampu ditentukan secara kuantitatif dengan metode analisa yang telah dikembangkan. Batas deteksi dan batas kuantisasi tersebut lebih kecil dari batas anilina yang masih diperbolehkan
yaitu 0,01% (b/b) setara dengan 0,8 μg/mL jika dikonversikan terhadap metode yang telah dikembangkan ini. Berdasarkan evaluasi terhadap sampel bahan baku tartrazin diperoleh kadar anilina sebesar 0,0302 µg/mL.
Pada uji akurasi dengan menggunakan metode spike terhadap bahan baku tartrazin diperoleh hasil rataan persentase perolehan kembali untuk kadar baku anilina sebesar 0,6; 0,8; dan 0,9 μg/ml berturut-turut adalah 82,74; 86,69; dan 85,58% dan nilai koevisien variansi (RSD) masing-masing sebesar 1,23; 1,84 dan 3,07%.
Tabel 6. Perhitungan Koefisien Variansi
| Kadar Anilin (µg/ml) | Absorbansi Hasil Pengukuran | Kadar Anilin Terukur | Rataan Kadar Anilin Terukur | Kadar Anilin Sampel Tartrazin | Chitung - Csampel | SD | KV |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0,0501 | 0,5315 | 0,0302 | 0,5013 | 0,0068 | 1,28 | ||
| 0,6 | 0,0499 | 0,5294 | 0,5266 | 0,4992 | |||
| 0,0489 | 0,5189 | 0,4887 | |||||
| 0,8 | 0,0674 | 0,7132 | 0,7141 | 0,6830 | 0,0132 | 1,84 | |
| 0,0696 | 0,7363 | 0,7061 | |||||
| 0,0682 | 0,7216 | 0,6914 | |||||
| 0,0665 | 0,7038 | 0,6736 | |||||
| 0,0662 | 0,7006 | 0,6704 | |||||
| 0,0670 | 0,7090 | 0,6788 | |||||
| 0,9 | 0,0740 | 0,7826 | 0,7822 | 0,7524 | 0,0240 | 3,07 | |
| 0,0754 | 0,7973 | 0,7671 | |||||
| 0,0777 | 0,8214 | 0,7912 | |||||
| 0,0729 | 0,7710 | 0,7408 | |||||
| 0,0714 | 0,7553 | 0,7251 | |||||
| 0,0724 | 0,7658 | 0,7356 |
Kesimpulan
Metode penentuan amina aromatik primer tidak tersulfonasi dihitung sebagai anilina dalam bahan baku zat warna tartrazin dapat dilakukan secara spektrofotometri menggunakan 2-naftol sebagai pereaksi pengkopling.
Daftar Pustaka
Connors KA, 1975, A Textbook of Pharmaceutical Analysis, 2<sup>nd</sup> ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, 216-220.
De Almeida-Filho J, De Souza, JM, 1983, A Simple Urine Test for Sulfonamides, Bulletin of The World Health Organization 61(1): 167-168.
Fessenden RJ, Fessenden JS, 1994, Organic Chemistry 5<sup>th</sup> ed., Brooks/Cole Publishing Company, California, 515-519.
Gottwald W, 2000, Statistik für Anwender, Wiley-VCH, Weinheim, 89 – 109.
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian 1(3): 117-135.
JECFA, 2006, Combined Compendium of Food Additive Specifications, FAO, Roma, 215-216.
Susanty S, 2011, Modifikasi Metode Bratton Marshall untuk Penetapan Kadar Sulfasetamida dalam Sediaan Tetes Mata, ITB, Bandung.