Pendahuluan
Jambu air (Syzygium aqueum) merupakan salah satu tanaman yang banyak dimanfaatkan untuk pengobatan berbagai penyakit. Tanaman ini berasal dari Asia Tenggara yaitu di daerah tropis seperti Indonesia (Jawa dan Sumatra). Berbagai bagian tanaman ini dimanfaatkan untuk pengobatan seperti daunnya yang memiliki aktivitas antimikroba, dan memiliki efek antihiperglikemia. Ekstrak daun jambu air memiliki aktivitas penghambatan enzim xanthin oksidase lebih besar dibandingkan suku Myrtaceae lainnya yaitu daun salam, daun jambu biji, daun kayu putih, dan daun cengkeh (Ramadania 2015). Daun jambu air mengandung tanin, glikosida, asam format, steroid, dan flavonoid (Manaharan 2013).
Delima (Punica granatum) merupakan tanaman yang berasal dari Asia dan berkembang pula di daerah Mediterania. Tanaman ini merupakan tanaman asli Asia, terutama di Iran, Afganistan, dan Himalaya. Kulit buah delima (Punica granatum) banyak digunakan untuk pengobatan berbagai penyakit. Buah delima banyak dimanfaatkan secara tradisional sebagai antibiotik, antikanker, antidiabetes, dan untuk pengobatan aterosklerosis (Bharani dan Namasivayam 2016).
Sel Vero adalah sel yang berasal dari ginjal normal monyet (African green monkey kidney). Sel ini merupakan jenis sel mamalia yang paling banyak digunakan untuk penelitian seperti studi intrasel bakteri, mengidentifikasi efek toksin, senyawa kimia, atau substansi lainnya terhadap sel mamalia. Penggunaan sel Vero untuk proses identifikasi efek dari suatu senyawa kimia dapat dilakukan melalui uji toksisitas senyawa kimia tersebut terhadap sel secara in vitro. Beberapa kelebihan penggunaan sel untuk pengujian toksisitas secara in vitro diantara lain pertumbuhannya yang cepat sehingga waktu yang dibutuhkan untuk pengujian lebih singkat, metode pengujian yang sederhana, dan dapat dilakukan pemilihan sel uji yang bersifat spesifik untuk tujuan penelitian yang diinginkan (Ekwall et al. 1990).
Uji toksisitas sel secara in vitro adalah salah satu
metode yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi keamanan pemakaian suatu obat atau senyawa kimia. Viabilitas sel dapat dihitung dengan menggunakan berbagai indikator yaitu integritas membran plasma, sintesis DNA, aktivitas enzim, dan kondisi reduksi seluler. Alamar blue merupakan salah satu indikator viabilitas sel. Sel hidup akan mereduksi komponen kimia berupa resazurin yang berada dalam reagen menjadi resorfurin dan menyebabkan perubahan warna dari biru menjadi merah. Perhitungan viabilitas sel dengan alamar blue dapat dilakukan melalui pembacaan absorbansi pada panjang gelombang 570 nm dan 600 nm (Ricardo et al. 2009).
Daun jambu air (Syzygium aqueum) dan kulit buah delima (Punica granatum) banyak dimanfaatkan sebagai obat tradisional dengan menggunakan ekstrak ataupun fraksi dari kedua bahan tersebut. Akan tetapi belum banyak dilakukan penelitian mengenai toksisitas ekstrak ataupun fraksi tanaman tersebut secara in vitro terhadap sel Vero. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah untuk menguji keamanan penggunaan ekstrak dan fraksi dari daun jambu air dan kulit buah delima secara in vitro terhadap sel Vero.
Percobaan
Bahan
Bahan yang digunakan yaitu Serbuk simplisia daun jambu air (Syzygium aqueum) dan kulit delima (Punica granatum), sel Vero (ATCC CCL-81), Dulbecco's Modified Eagle's Medium dengan 4 Mm L-glutamin (Lonza), Fetal Bovine Serum (Life Technologies), tripsin/EDTA, PBS, penisilin streptomisin (Life Technologies), Dimetilsulfoksida, kloralhidrat, etanol, etil asetat, n-heksana, akuades, vaselin, toluen, kloroform, asam klorida, amonia, pereaksi Dragendorff (bismuth nitrat dan kalium iodida dalam asam klorida pekat dan air), pereaksi Mayer (raksa (II) klorida dan kalium iodida dalam asam klorida pekat dan air), pereaksi Steasny (formaldehid 30% dalam asam klorida pekat dengan perbandingan 2:1), besi (III) klorida, larutan gelatin, NaOH, pereaksi Liebermann Burchard (asam asetat pekat dan asam sulfat pekat 2:1), silika gel GF 254, reagen alamar blue (Invitrogen), amil alkohol.
Pemeriksaan Mutu dan Karakterisasi Simplisia
Karakterisasi dari simplisia meliputi pemeriksaan mikroskopik, dan pemeriksaan kualitas simplisia ditinjau dari susut pengeringan, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol, kadar abu total, dan kadar abu tidak larut asam.
Ekstraksi dan Pemantauan Ekstrak
Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi untuk simplisia daun jambu air, dan dengan metode refluks untuk simplisia kulit buah delima. Kedua simplisia diekstraksi sebanyak tiga kali dengan menggunakan tiga pelarut dengan kepolaran yang meningkat yaitu n-heksan, etil asetat, dan etanol. Ekstrak yang diperoleh diuapkan dengan alat penguap berputar (rotavapor), dipekatkan, dan dihitung rendemen ekstraknya. Masing-masing ekstrak yang diperoleh dipantau dengan kromatografi lapis tipis (KLT) pada panjang gelombang (λ) 254 nm dan 366 nm. Pemantauan ekstrak dengan penampak bercak universal yaitu H2SO410% dalam metanol, dan penampak bercak spesifik sitroborat.
Fraksinasi dan Pemantauan Fraksi
Ekstrak etanol dari daun jambu air dan kulit buah delima dilarutkan dalam akuades dan difraksinasi dengan metode ekstraksi cair-cair (ECC) menggunakan pelarut n-heksan, dan etil asetat sebanyak tiga kali berturut-turut untuk setiap pelarut sehingga diperoleh fraksi n-heksan, etil asetat, dan air. Hasil fraksinasi dipekatkan dengan alat penguap berputar (rotavapor), dipekatkan, dan dihitung rendemen fraksinya. Fraksi yang diperoleh dipantau dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase diam silika gel GF254 pada panjang gelombang (λ) 254 nm dan 366 nm. Pemantauan fraksi dilakukan dengan penampak bercak universal yaitu H2SO410% dalam metanol, dan penampak bercak spesifik sitroborat.
Kultur Sel Vero
Sel Vero ditumbuhkan dalam media Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) dengan glutamin yang ditambahkan 10 % Fetal Bovine Serum (FBS), dan 1% penisilin-streptomisin. Sel yang telah ditumbuhkan dalam media tersebut diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator pada kondisi tekanan CO25% dan suhu 37˚C. Kultivasi sel dilakukan setiap 2-3 hari sekali dengan cara, media lama tempat sel tersebut tumbuh diambil dengan menggunakan mikropipet kemudian dibuang. PBS ditambahkan pada kultur sel kemudian dilakukan proses tripsinasi. Proses tripsinasi dilakukan dengan penambahan tripsin pada kultur sel, proses tripsinasi berlangsung selama 3-4 menit. Sel yang telah ditripsinasi ditambahkan media tumbuh segar dan diambil sejumlah tertentu suspensi sel dengan rasio 1:5 atau 1:10 untuk ditumbuhkan pada wadah baru dengan media tumbuh segar. Sel hasil kultivasi diinkubasi dalam inkubator pada kondisi CO25% dan suhu 37˚C.
Uji Toksisitas secara in vitro terhadap Sel Vero
Sel ditumbuhkan pada wadah 96-well dengan konsentrasi 10.000 sel/well. Sel tersebut kemudian diinkubasi selama 24-48 jam hingga sel tumbuh konfluen 80-100%. Setelah sel tumbuh konfluen, larutan stok ekstrak dan fraksi dibuat dengan melarutkan sejumlah tertentu ekstrak dan fraksi dengan DMSO. Ekstrak dan fraksi dibuat beberapa seri konsentrasi yaitu 1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, dan 2 µg/ml pada wadah 96 well dengan cara mengencerkan larutan stok dengan media tumbuh sel. Media pertumbuhan sel dalam well diganti dengan larutan ekstrak atau fraksi yang telah diencerkan dalam media pertumbuhan. Larutan DMSO juga diuji aktivitasnya terhadap sel dengan menambahkan sejumlah volume yang sama dengan banyaknya ekstrak dan fraksi yang diuji aktivitasnya terhadap sel. Sel yang telah ditambahkan ekstrak dan fraksi diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator pada kondisi CO25% dan suhu 37˚C . Setelah inkubasi 24 jam dilakukan penambahan reagen alamar blue sebanyak 10% pada masingmasing well dan diinkubasi selama 4 jam. Penentuan viabilitas sel dilakukan dengan pembacaan absorbansi yang dihasilkan pada sel yang telah ditambahkan ekstrak dan fraksi uji. Pembacaan absorbansi dilakukan dengan menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 570 nm dan 600 nm. Data absorbansi yang diperoleh diubah menjadi data persentase viabilitas sel yang menunjukkan banyaknya sel yang hidup pada masing-masing ekstrak dan fraksi yang diuji.
Hasil dan Pembahasan
Daun jambu air yang diperoleh disortasi, dicuci, dikeringkan dan dijadikan serbuk. Kulit buah delima diperoleh melalui pemisahan bagian buah dan biji delima, kulit buah delima yang diperoleh disortasi, dicuci, dan digiling untuk kemudian dijadikan serbuk. Serbuk simplisia dikarakterisasi untuk menentukan kualitas mutu simplisia yang digunakan. Karakterisasi simplisia yang dilakukan meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar abu total, kadar abu tidak larut asam, kadar sari larut etanol, kadar sari larut air, kadar air, dan susut pengeringan (Tabel 1).
Tabel 1. Karakterisasi Simplisia Daun Jambu Air (SJ) dan simplisia kulit delima (SK).
| Karakterisasi | Hasil (% | |
|---|---|---|
| simplisia | b/b) | |
| Rata rata SJ ± | Rata rata SK | |
| SD | ± SD | |
| Kadar abu total | 6,05 ± 0,23 | 3,44 ± 0,007 |
| Kadar abu tidak larut | 1,49 ± 0,20 | 0,53 ± 0,46 |
| asam | ||
| Kadar sari larut etanol | 13,27 ± 0,16 | 37,77 ± 0,13 |
| Kadar sari larut air | 12,08 ± 0,87 | 41,9 ± 0,05 |
Keterangan :
SD = standar deviasi
SJ = simplisia daun jambu air
SK = simplisia kulit buah delima
Pemeriksaan makroskopik daun jambu air menunjukkan bahwa daun jambu air memiliki karakteristik berbentuk bulat telur, berwarna hijau dengan permukaan atas mengkilap, ujung daun meruncing, dan memiliki sedikit bau aromatik dengan panjang 7-16 cm, sedangkan kulit buah delima memiliki karakterikstik berbentuk bulat menyerupai buahnya, dan berwarna kuning kecoklatan. Berdasarkan pemeriksaan mikroskopik, daun jambu air
memiliki komponen penyusun berupa sel parenkim dan rambut penutup, sedangkan pada kulit buah delima dapat teramati adanya sel parenkim (Gambar 1).
Gambar 1. Pengamatan mikroskopik simplisia (A) sel parenkim daun jambu air (B) rambut penutup daun jambu air (C) sel parenkim kulit buah delima, menggunakan kloral hidrat dengan perbesaran 40 x.
Simplisia yang telah dikarakterisasi diekstraksi bertingkat dengan metode maserasi untuk simplisia daun jambu air dan refluks untuk simplisia kulit buah delima. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi baik pada daun jambu air maupun kulit buah delima adalah pelarut dengan kepolaran yang meningkat yaitu nheksana, etil asetat, dan etanol. Hasil ekstraksi yang diperoleh dipekatkan dan dipantau menggunakan KLT. Penapisan fitokimia dilakukan pada simplisia dan ekstrak untuk mengetahui keberadaan golongan senyawa kimia berupa metabolit sekunder yang terdapat pada simplisia dan ekstrak. Pada ekstrak etanol dan simplisia baik daun jambu air maupun kulit buah delima terdapat berbagai golongan senyawa kecuali alkaloid, sedangkan pada ekstrak n-heksana dan etil asetat tidak terdapat kandungan
golongan senyawa metabolit sekunder yang diuji (Tabel 2).
Tabel 2. Penapisan Fitokimia Simplisia dan Ekstrak Daun Jambu Air dan Kulit Buah Delima.
| Ekstrak | ||||
|---|---|---|---|---|
| Golongan | Simplisia | n | etil | etano |
| senyawa | heksana | asetat | l | |
| Alkaloid | - | - | - | - |
| Flavonoid | √ | - | - | √ |
| Fenol | √ | - | - | √ |
| Tanin | √ | - | - | √ |
| Kuinon | √ | - | - | √ |
| Saponin | √ | - | - | √ |
| Steroid/tri | ||||
| - terpenoid | √ | - | - | √ |
Keterangan :
(-) = tidak terdeteksi
(√) = terdeteksi
Fraksinasi ekstrak etanol dari daun jambu air dan kulit buah delima dilakukan dengan menggunakan metode ekstraksi cair-cair (ECC) menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat. Fraksi yang diperoleh dipekatkan dan dipantau dengan menggunakan KLT. Ekstrak dan fraksi yang diperoleh diuji toksisitasnya terhadap sel Vero yang sebelumnya telah dikultur. Seluruh ekstrak dan fraksi uji dibuat larutan stok dengan melarutkannya dalam DMSO dan dibuat beberapa seri konsentrasi ekstrak dan fraksi dalam media kemudian ditambahkan alamar blue sebagai indikator viabilitas sel. Penentuan persentase viabilitas sel ekstrak dan fraksi dilakukan dengan mengubah data absorbansi sel yang dihasilkan pada panjang gelombang 570 nm dan 600 nm. Persentase viabilitas ekstrak uji dibandingkan dengan DMSO sebagai pelarut. Jika terdapat toksisitas terhadap sel, penambahan DMSO dan ekstrak dapat menyebabkan perubahan morfologi pada sel Vero. Adanya zat yang bersifat toksik dapat menyebabkan gangguan permeabilitas sel, terjadinya reduksi fungsi mitokondria sel, perubahan replikasi sel, dan perubahan morfologi sel (Eisenbrand et al. 2002). Sel yang mengalami kematian akan mengalami perubahan bentuk dan mengalami perubahan warna menjadi lebih gelap dikarenakan adanya perubahan permeabilitas membran sel yang menyebabkan keluarnya cairan sitoplasma pada sel (Gambar 6).
Gambar 1. Morfologi sel vero (A) Belum mengalami pertumbuhan, (B) telah mengalami pertumbuhan, (C) setelah penambahan DMSO 10%, (D) setelah penambahan ekstrak 1,024 mg/ml.
Berdasarkan penelitian, pada konsentrasi ekstrak 1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, dan 2 µg/ml tidak terdapat ekstrak daun jambu air maupun kulit buah delima yang menghambat 50% pertumbuhan sel dibandingkan dengan hasil normalisasi terhadap DMSO konsentrasi terendah (Gambar 2 dan Gambar 3).
Gambar 2. Grafik persentase viabilitas sel terhadap DMSO, ekstrak n-heksana, ekstrak etil asetat, dan ekstrak etanol daun jambu air.
Gambar 3. Grafik persentase viabilitas sel terhadap ekstrak n-heksana, ekstrak etil asetat, dan ekstrak etanol kulit buah delima. .
Esktrak dinyatakan toksik apabila memiliki nilai IC50 31-200 µg/ml dan bersifat tidak toksik apabila memiliki nilai IC50 diatas 1000 µg/ml (McLaughlin et al 1998). Berdasarkan hasil uji toksisitas pada fraksi n-heksan, etil asetat, dan air dari daun jambu air dan kulit buah delima pada konsentrasi 1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, dan 2 µg/ml tidak terdapat satu fraksi pun yang menghambat pertumbuhan sel sebesar 50% dibandingkan terhadap hasil normalisasi terhadap DMSO pada konsentrasi terendah (Gambar 4 dan Gambar 5).
Gambar 4. Grafik persentase viabilitas sel terhadap DMSO, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi air daun jambu air.
Gambar 5. Grafik persentase viabilitas sel terhadap DMSO, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi air kulit buah delima.
Penggunaan sel Vero untuk proses identifikasi efek dari suatu senyawa kimia dapat dilakukan melalui uji toksisitas senyawa kimia tersebut terhadap sel secara in vitro. Beberapa kelebihan
penggunaan sel untuk pengujian toksisitas secara in vitro diantara lain pertumbuhannya yang cepat sehingga waktu yang dibutuhkan untuk pengujian lebih singkat, metode pengujian yang sederhana, dan dapat dilakukan pemilihan sel uji yang bersifat spesifik untuk tujuan penelitian yang diinginkan (Ekwall et al. 1990). Sel Vero banyak digunakan untuk penelitian diantara lain, pengujian toksisitas ekstrak keong matah merah (Cerithidea obtusa) terhadap Artemisia salina dan sel Vero. Pengujian menunjukkan bahwa seluruh ektrak uji bersifat nontoksik terhadap sel Vero (Aulia 2016). Dalam penelitian lain dilakukan pengujian aktivitas sitotoksisitas in vitro ekstrak Solanum nigrum terhadap sel Hela dan sel Vero. Pengujian menunjukkan bahwa ekstrak memiliki aktivitas yang tinggi pada sel Hela, sedangkan aktivitas ekstrak terhadap sel Vero rendah (Patel et al. 2009). Hal ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan, seluruh ekstrak dan fraksi daun jambu air dan kulit buah delima yang diuji memiliki aktivitas yang rendah atau bersifat nontoksik terhadap sel Vero.
Ekstrak etanol daun jambu air memiliki nilai IC50 aktivitas peredaman DPPH sebesar 220 µg/ml (Ling dan Palanisamy 2012). Ekstrak daun jambu air tidak bersifat toksik pada pengujian in vivo dengan hewan percobaan. Ekstrak etanol daun jambu air memiliki nilai LD50 lebih dari 2000 mg/kg. Ektrak etanol sebesar 50, 100, dan 200 mg/kg yang diberikan selama 28 hari tidak menyebabkan kematian pada hewan uji. Hal tersebut menunjukkan tidak adanya efek toksisitas akut dan subkronis dari ekstrak daun jambu air (Manaharan et al. 2014). Hasil uji in vivo ekstrak kulit buah delima yang telah dilakukan sebelumnya menunjukkan bahwa pemberian ekstrak dengan dosis 0,5 mg/kg, 1,9 mg/kg, dan 7,5 mg/kg selama 22 hari tidak memberikan efek toksik, dan kematian pada hewan uji (Jahromi et al. 2014).
Kesimpulan
Ekstrak dan fraksi dari daun jambu air dan kulit buah delima tidak bersifat toksik pada konsentrasi024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, dan 2 µg/ml terhadap sel Vero
Gambar 7. Kromatografi Lapis Tipis pemantauan ekstrak daun jambu air (A) pada λ 254 nm, (B) sinar tampak, (C) pada λ 366 nm, (D) dengan penampak bercak H2SO4 10%, (1) ekstrak n-heksan, fase gerak heksan-etil-asam format (9:1:1), (2) ekstrak etil asetat, heksan-etil (8:2), (3) ekstrak etanol, fase gerak heksan-etil-etanol(8:2:1).
Gambar 8 Kromatografi Lapis Tipis pemantauan ekstrak kulit buah delima (A) pada λ 254 nm, (B) sinar tampak, (C) pada λ 366 nm, (D) dengan penampak bercak H2SO4 10%, (1) ekstrak n-heksan, fase gerak toluen-heksan-etil (2:2:1), (2) ekstrak etil asetat, fase gerak heksan:etil (3:10) (3) ekstrak etanol, fase gerak kloroform-asam aetat-asam format (2:4:1).
Gambar 9 Kromatografi Lapis Tipis pemantauan fraksi daun jambu air (A) pada λ 254 nm, (B) pada sinar tampak, (C) pada λ 366 nm, (D) dengan penampak bercak H2SO4 10%, (1) fraksi heksan, fase gerak heksan-etil asetat-asam format (9:1:1), (2) fraksi etil asetat, fase gerak heksan-etil asetat-asam format (9:1:1), (3) fraksi air, fase gerak metanol-air (4:1).
Gambar 10. Kromatografi Lapis Tipis pematauan fraksi kulit buah delima, (A) pada λ 254 nm, (B) pada sinar tampak, C) pada λ 366 nm, (D) dengan penampak bercak H2SO4 10%, (1) fraksi heksan, fase gerak toluene-heksanetil (2:2:1), (2) fraksi etil asetat, fase gerak heksan-etil (3:10), (3) fraksi air, fase gerak kloroform-asam asetatasam format (2:4:1).