PENDAHULUAN
Heparin merupakan antikoagulan gologan polisakarida alami yang paling banyak digunakan dalam praktik klinis. Heparin adalah salah satu makromolekul alami yang paling kompleks, ditandai dengan polidispersitas berat molekul, mikroheterogenitas dalam struktur, dan polaritas kuat dengan muatan sangat negatif. Heparin dilaporkan memiliki efek samping seperti osteoporosis, trombositopenia, dan perdarahan, karena rantai gulanya yang panjang. Untuk mengatasi masalah ini, heparin dengan berat molekul rendah (LMWHs) mulai digunakan dalam praktik klinis untuk mengurangi efek samping dan meningkatkan bioavailabilitas. Enoksaparin menjadi salah satu heparin dengan berat molekul rendah (LMWH) yang lebih sering digunakan sebagai antikoagulan (Zhu et al. 2024).
Pada awal tahun 2020 disaat pandemi covid-19 yang cepat berkembang menjadi gagal napas banyak pasien memerlukan rawat inap untuk dukungan pernapasan hingga ventilasi invasif. Pasien yang dirawat di rumah sakit secara inheren berisiko tinggi mengalami tromboemboli vena (VTE) karena infeksi akut yang diatasi dengan penggunaan golongan heparin berat molekul rendah (LMWH) yaitu enoksaparin atau heparin tak terfraksi (UFH) yaitu fondaparinux (Cosmi et al. 2023). Terapi antikoagulan dapat menurunkan angka kematian pada pasien COVID-19 saat itu dengan koagulopati yang disebabkan oleh sepsis, suatu kondisi yang disebut koagulopati terinduksi sepsis (SIC) (Debora et al. 2022). Penggunaan antikoagulan pada beberapa pasien yang juga mengalami gagal ginjal dapat menyebabkan perdarahan sehingga diperlukan monitoring terapi obat (TDM).
Metode analisis untuk golongan heparin terutama enoksaparin dalam plasma darah membutuhkan preparasi yang rumit dan panjang. Beberapa metode analisis bahan aktif dalam darah membutuhkan Solid Phase Extraction (SPE), ekstraksi cair-cair dan polimer tercetak molekul (MIP) yang akan digunakan sebagai adsorben (Nuriah et al. 2023)(Melia & Hasanah 2017). Metode kromatografi size-exclution (SEC) telah dikembangkan pada penelitian terdahulu untuk menganalisis enoksaparin. Kondisi kromatografi yang optimal menggunakan kolom TSK gel G5000PWXL (10 µm, 7.8 mm × 300 mm) dengan laju alir 0.6 mL/min pada suhu 37 °C dengan gradien isokratik. Fase gerak buffer fosfat (pH 7.0; 10 mM) dengan panjang gelombang deteksi 232 nm. Metode yang dikembangkan linier, akurat dan robust sehingga memberikan cara mudah untuk memantau kapasitas pembentukan kompleks enoksaparin dengan PF4 (Wu et al. 2019). Kualitas heparin dinilai secara berkala oleh SEC dan kriteria pelepasan produk yang ketat telah ditetapkan dalam farmakope. masing-masing massa molar rata-rata berat < 8000 g/mol, dan fraksi massa > 60% dengan massa molar < 8000 g/mol. Pentingnya jaminan mutu heparin yang tepat menjadi jelas ketika lebih dari 100 orang meninggal dan beberapa ribu pasien jatuh sakit pada tahun 2008 setelah beberapa perusahaan farmasi gagal menemukan bahan heparin palsu yang digunakan dalam produksi. Kerugian menggunakan SEC adalah resolusinya rendah serta harga kolom yang mahal (Held & Kilz 2021).
Tujuan dari penelitian ini adalah mengembangkan dan validasi metode analisa untuk heparin atau enoksaparin yang dapat digunakan untuk mengukur kadar heparin dan enoksaparin pada hasil adsorpsi MIP. Metode yang dikembangkan menggunakan kromatografi pasangan ion dengan pereaksi tetra n-butil ammonium hidroksida yang ditambahkan pada fase gerak. Adapun detektor yang digunakan adalah photo diado array (PDA) dengan kolom C8. Pengembangan metode analisis ini diharapkan dapat menghasilkan metode analisis yang murah dan valid untuk dapat mengukur kadar enoksaparin atau heparin dari hasil adsorpsi pada MIP.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Heparin (Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japan), enoksaparin Na (BetaPharma Co. Ltd., Shanghai, China), aqua pro injection (Ika Pharmindo), tetra nbutyl ammonium hidroksida (TBAH) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) NaCl (Merck) dan Asetonitril pro-HPLC (Merck.) membrane filter 0.2 μm (Agilent).
Peralatan
Seperangkat alat KCKT (Agilent, Santa Clara, CA, USA), Kolom Zorbax Eclipse Plus C8 4,6 x 250 mm, 5µm (Agilent, Santa Clara, CA, USA).
Metode
Pembuatan larutan standar
Larutan Standar Heparin dan enoksaparin dibuat dengan konsentrasi 1000 ppm. Larutan standar kerja heparin dan enoksaparin dibuat dibuat dengan konsentrasi 100, 200, 300, 400 dan 500 mg/mL dari pengenceran larutan standar awal.
Optimasi KCKT
Komposisi fasa gerak yang digunakan fase gerak A yaitu 300 mM NaCl ditambah dengan reagen pasangan ion 10 mM tetra n-butil ammonium hidroksida (TBAH) dengan fase gerak B yaitu asetonitril menggunakan sistem gradien seperti pada tabel 1. Panjang gelombang yang digunakan adalah 231 nm. Laju aliran dalam instrumen KCKT diatur 1,00 mL/menit dan volume injeksi 100 µl.
Tabel 1. Sistem gradient KCKT pasangan ion untuk heparin atau enoksaparin
| Waktu | Fase gerak A | Fase gerak B |
|---|---|---|
| (menit) | (%) | (%) |
| 0,00 | 100,0 | 0,0 |
| 1,00 | 95,0 | 5,0 |
| 3,00 | 0,0 | 100,0 |
| 10,00 | 0,0 | 100,0 |
| 11,00 | 100,0 | 0,0 |
Uji Validasi
Selektivitas
Uji selektivitas heparin atau enoksaparin dilakukan dengan melihat nilai resolusi atau pemisahan (Rs), dengan nilai diatas 1,5 (Astuti et al. 2019).
Linearitas
Larutan kerja standar heparin atau enoksaparin diinjeksikan sebanyak 100 μL ke dalam sistem KCKT. Kromatogram dicatat, dibuat kurva kalibrasi, kemudian dihitung persamaan regresi dan koefisien korelasinya. Kurva kalibrasi dibuat dengan memplot luas puncak pada sumbu y dan konsentrasi pada sumbu x. Kemudian dilakukan analisis nilai r. Apabila nilai r2 lebih besar dari 0,990, maka nilai r hitung memenuhi syarat (Muhammad et al. 2024). Selain itu dihitung nilai Vxo tidak lebih besar dari 5%.
Akurasi dan Presisi
Akurasi dinyatakan sebagai perbandingan antara hasil yang diperoleh dengan hasil sebenarnya dengan tiga konsentrasi berbeda dan masingmasing konsentrasi direplikasi sebanyak tiga kali. Akurasi memenuhi persyaratan jika perolehan kembali masuk direntang 90-110% (USP, 2011) serta presisi memenuhi syarat dengan nilai RSD kurang dari 2.5% (Bhujbal et al. 2024).
Batas deteksi dan batas kuantifikasi
batas deteksi (LOD) adalah konsentrasi obat terendah yang dapat dideteksi dalam sampel tetapi tidak dapat diukur secara andal. LOD ditentukan sebagai konsentrasi di mana rasio signal-to-noise minimal 3:1. sedangkan Batas kuantisasi (LOQ) adalah konsentrasi obat terendah yang dapat ditentukan secara kuantitatif yang ditentukan sebagai konsentrasi obat terendah dalam rentang linier dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima dan dengan rasio signal-to-noise minimal 10:1 (Tamer et al. 2024).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada pengembangan metode analisis KCKT dilakukan optimasi pemilihan panjang gelombang deteksi, pelarut yang digunakan dan pemilihan fase gerak yang digunakan pada proses elusi. Metode analisis yang dikembangkan ini adalah metode analisis untuk enoksaparin atau heparin. Sistem kromatografi hasil pengembangan metode analisis meliputi fase diam yaitu kolom C8, fase gerak A yaitu 300 mM NaCl ditambah dengan reagen pasangan ion 10 mM tetra n-butil ammonium hidroksida (TBAH) dengan fase gerak B yaitu asetonitril menggunakan sistem gradien seperti pada tabel 1 yang dikembangkan dari metode analisis pada literatur (Galeotti & Volpi 2013). Panjang gelombang deteksi 231 nm, dan volume injeksi 100 μL dengan laju alir 1 ml/menit. Kromatogram enoksaparin, heparin dan air sebagai pelarut senyawa dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. kromatogram air, enoksaparin 500 mg/L, dan heparin 500 mg/L
Spesifisitas atau selektivitas metode diselidiki dengan menyuntikkan sampel kosong (air deionisasi sebagai pelarut senyawa) untuk menunjukkan tidak adanya gangguan pada elusi heparin atau enoksaparin (Savadkouhi et al. 2017). Hasil pengujian selektivitas diperoleh bahwa puncak heparin ataupun enoksaparin muncul di Rt (retention time) 4,1 menit. Nilai resolusi terhadap
puncak eluen untuk heparin adalah 3,49 sedangkan enoksaparin adalah 3,74. Hasil pemisahan ini memenuhi persyaratan terpisah dari puncak lainnya dan nilai resolusinya lebih besar dari 1,5 (Rosydiati 2019).
Linearitas merupakan kemampuan metode analisis dalam memberikan respon yang baik dan proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel (Harmita 2004). Hasil pengujian linieritas pada rentang konsentrasi 100 – 500 mg/L, diperoleh bahwa untuk kedua senyawa yaitu enoksaparin dan heparin memenuhi syarat linieritas dengan nilai R2 untuk kurva linieritas enoksaparin dan heparin masing-masing sebesar 0,9994 dan 0,9965. Nilai Vxo dari linieritas untuk enoksaparin dan heparin masing-masing sebesar 1,51 % dan 3,60 % tidak lebih dari 5,0 % (Rahman et al., 2020). Dari pengujian linieritas juga dapat langsung ditentukan nilai batas deteksi dan batas kuantitas metode analisis. Nilai LOD dan LOQ untuk enoksaparin adalah sebesar 13,59 ppm dan 45,29 ppm, sedangkan nilai LOD dan LOQ heparin sebesar 32,42 ppm dan 108,08 ppm. Nilai linieritas, LOD dan LOQ dapat dilihat pada Tabel 2 dan 3.
Tabel 2. Data linieritas validasi metode analisis KCKT untuk enoksaparin
| Kadar (mg/L) | 𝑋 area | SD | |
|---|---|---|---|
| 100 | 1200,533 | 12,16237 | |
| 200 | 2337,733 | 52,54125 | |
| 300 | 3591,867 | 52,07037 | |
| 400 | 4922,533 | 92,55757 | |
| 500 | 6110,033 | 91,4383 | |
| Persamaan garis regresi | y=12,404x-88,6 | ||
| R2 | 0,9994 | ||
| Vxo (%) | 1,51 | ||
| LOD (mg/L) | 13,59 | ||
| LOQ (mg/L) | 45,29 | ||
Tabel 3. Data linieritas validasi metode analisis KCKT untuk heparin
| Kadar (mg/L) | 𝑋 area | SD | |
|---|---|---|---|
| 100 | 57,66667 | 1,001665 | |
| 200 | 135,7333 | 2,400694 | |
| 300 | 186,0667 | 3,118226 | |
| 400 | 253,6667 | 1,350309 | |
| 500 | 325,5 | 4,150904 | |
| Persamaan garis regresi | y=0,6536x-4,3533 | ||
| R2 | 0,9965 | ||
| Vxo (%) | 3,60 | ||
| LOD (mg/L) | 32,42 | ||
| LOQ (mg/L) | 108,08 | ||
Akurasi pada metode analisis dapat didefinisikan sebagai kedekatan hasil pengujian yang diperoleh metode tersebut dengan nilai sebenarnya. Hasil ini dinyatakan sebagai persen pemulihan. Presisi pada metode analisis dapat didefinisikan sebagai kedekatan antara serangkaian pengukuran yang diperoleh dari beberapa pengambilan sampel dari sampel standar yang sama di bawah kondisi yang ditentukan (Sushila Dagadu Chavan & Deepa Mahendra Desai 2022). Hasil pengujian akurasi dan presisi dilakukan pada tiga konsentrasi larutan enoksaparin dan heparin, yaitu 250, 300 dan 350 mg/L. Masing-masing konsentrasi larutan dipreparasi sebanyak 3 kali, kemudian diinjeksikan ke dalam sistem KCKT.
Hasil pengujian untuk parameter akurasi dan presisi dapat dilihat pada Tabel 4 dan Tabel 5. Hasil menunjukkan bahwa % recovery memenuhi syarat dan berada pada rentang yang dipersyaratkan yaitu sebesar 90,0 – 110,0 % untuk penetapan kadar zat aktif (USP, 2011). Parameter persen recovery ini merupakan parameter yang dijadikan acuan pada penentuan akurasi metode analisis. Dari data nilai RSD dapat dinyatakan bahwa presisi metode analisis adalah memenuhi syarat, karena berada pada nilai di bawah 2,0 % baik enoksaparin maupun heparin.
Tabel 4. Data akurasi dan presisi validasi metode analisis enoksaparin dengan metode KCKT
| Konsentrasi (mg/L) | Area | Recovery (mg/L) | Recovery (%) |
|---|---|---|---|
| 250 | 3014 | 250,13 | 100,05 |
| 250 | 2919,8 | 242,53 | 97,01 |
| 250 | 2874,8 | 238,91 | 95,56 |
| 300 | 3651,5 | 301,52 | 100,51 |
| 300 | 3555,4 | 293,78 | 97,93 |
| 300 | 3568,7 | 294,85 | 98,28 |
| 350 | 4083,9 | 336,38 | 96,11 |
| 350 | 4143,1 | 341,16 | 97,47 |
| 350 | 4150,3 | 341,74 | 97,64 |
| Rata-rata | 97,84 | ||
| SD | 1,6298 | ||
| RSD | 1,67 | ||
Tabel 5. Data akurasi dan presisi validasi metode analisis heparin dengan metode KCKT
| Konsentrasi (mg/L) | Area | Recovery (mg/L) | Recovery (%) |
|---|---|---|---|
| 250 | 160,3 | 251,86 | 100,74 |
| 250 | 157,7 | 247,88 | 99,15 |
| 250 | 159,1 | 250,02 | 100,01 |
| 300 | 184,9 | 289,49 | 96,50 |
| 300 | 189,6 | 296,68 | 98,89 |
| 300 | 184,3 | 288,58 | 96,19 |
| 350 | 223,4 | 348,40 | 99,54 |
| 350 | 221,3 | 345,19 | 98,62 |
| 350 | 222,9 | 347,63 | 99,32 |
| Rata-rata | 98,78 | ||
| SD | 1,5132 | ||
| RSD | 1,53 |
Dalam pemisahan kromatografi pasangan ion, retensi analit ditentukan oleh beberapa faktor seperti hidrofobisitas fase diam, konsentrasi organik fase gerak, muatan analit pada pH percobaan, serta muatan, konsentrasi dan hidrofobisitas reagen pasangan ion yang digunakan. Dalam model retensi elektrostatik melalui pasangan ion, reagen pasangan ion hidrofobik pertama-tama diserap ke permukaan fase diam hidrofobik, muatan positif dari reagen
pasangan ion alkil ammonium berinteraksi seara elektrostatis dengan disakarida pada enoksaparin melalui muatan negatif yang dihasilkan oleh gugus karboksilat dan sulfonatnya. Pembentukan pasangan ion elektrostatik juga dapat terjadi pada fase gerak sebelum interaksi dengan fase diam dengan retensi pasangan ion terjadi pada permukaan fase diam. Kelemahan pasangan ion ini adalah kesetimbangan kolom membutuhkan waktu lebih lama setelah perubahan fase gerak, sedangkan pada penelitian ini digunakan sistem gradien, sehingga waktu retensi sering bergeser (Jones et al. 2010)(Andraws & Trefi 2020).
KESIMPULAN
Metode KCKT pasangan ion yang dikembangkan menggunakan (300 mM NaCl + 10 mM TBAH) : asetonitril menggunakan sistem gradien untuk analisis heparin atau enoksaparin memenuhi parameter validasi metode yang ditetapkan.
UCAPAN TERIMAKASIH
Pendanaan Penelitian Block Grant Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Malang Tahun 2024.