PENDAHULUAN
Cyclophosphamide, suatu agens antitumor yang sangat ampuh, tergolong dalam kelompok "alkylating agents" dan merupakan obat yang digunakan untuk chemotherapi kanker. Cyclophosphamide mempunyai rumus:
Percobaan Foye et al. (1960) membuktikan, bahwa obat ini sangat baik hasilnya dalam therapi malignant lymphoma, epidermoid carcinoma paru-paru dan epidermoid carcinoma larynx.
Cyclophosphamide yang diinjeksikan secara intraperitoneal pada mencit yang sedang mengandung pada hari-hari ke-9 sampai 14 dengan dosis 20 mg/kg menyebabkan bertambahnya jumlah embryo yang diresorpsi dan juga mempunyai efek teratogenik yang bermacam-macam, seperti: "cleft palate", exencephali, kelain-an-kelainan pada digit, ekor yang pendek, polydactyli, syndactyli, ectrodactyli, adactyli, bersatunya tulang-tulang panjang, bengkoknya tulang-tulang panjang, hilangnya rusuk, mata terbuka, aphakia, microphakia, hydronephrosis dan hydrocephalus (Gibson dan Becker, 1968).
Cyclophosphamide juga bersifat teratogenik pada tikus dengan dosis 7-10 mg/kg hanya bila diinjeksikan secara intraperitoneal pada hari-hari mengandung yang ke-11 dan 12. Anomali yang didapat adalah: exencephali, "cleft palate", kaki-kaki yang abnormal dan juga ekor yang abnormal (Chaube \(et\ al.\), 1967).
Penelitian yang dilakukan sekarang ini bertujuan untuk mempelajari bagaimana pengaruh cyclophosphamide bila diinjeksikan ke dalam kantung yolk embryo ayam yang sudah memperlihatkan pertumbuhan dari tunas-tunas ekstrimitas.
BAHAN DAN TAI]AKERJA
Telur-teILrr fertil ayam "white leghorn" diperoleh dari peternak ayam "Missouri" di Bandung.
Telur-telur diinkubasikan dengan menggunakan mesin-mesin penetas telur buatan "Missouri" Bandung, Setelah embryo berurnur 1r dan 5 hari inkubasi, telur-telur diinjeksi dengan larutan Endoxan-Asta. Injeksi dilakukan ke dalam kantung yolk dengan dosis 0.04 mg per telur sebanyak 0.02 cc. Embryo-embr:yo seri kontrol diinjeksi dengan aquabidestilata sebanyak 0.2 cc per telur.
Telur-te1ur kemudian di.inkubasikan kernbali sampai umur 16 hari. Sesudah umur ini tercapai, embryo dibunuh, diperiksa abnormalitas-abnormalitas norfologis yang dideritanya dan kemudian ditimbang bera:nya. Ernbryo-embryo yang berurnur lebih tua dari t hari dan tidak dapat mencapai umur 16 hari, dlper- =----{kukan sama, hanya saja tldak ditirnbang beratnya. Untuk pe-V/arnaan rangka digunakan metoda pewarnaan dengan Alizarin \ed S (Conn, 1960).
HASIL PENGAI'IATAN
Malformasi yang ditimbulkan oleh Endoxan-Asta bila dl- injeksikan ke dalam kantung yolk pada umur 4 hari dan 5 harl inkubasi adalah:
- Pada mata : Gelembung meliputl mata (Gambar I)
- Kelopak mata tidak turnbuh, s€ hingga mata terbuka (Garnbar II)
- MaEa tidak tumbuh sama seka1l (Gambar III)
- : Pada paruh Sisi lateral paruh bercelah (Ganbar IV)
- Paruh bawah pendek (Gambar IV)
- Paruh atas pendek (Gambar V)
- Paruh atas dan bawah pendek (Ganbar I, VI, VII)
- Paruh menyilang
Pada ekstrimitas belakang: - Micromelia (Ganbar I, II, VII)
Pada digiti ekstrimitas
belakang : -
- Syndactyli (Gambar V,VII)
- Ectrodactyli (Garnbar I, II, VII)
- Melengkung
- Salah arah (Garnbar Vi)
Ganbar I: Embryo ayam umur 15 hari yang dii-njeksi dengan 0.04 mg Endoxan*Asta pada umur 5 hari inkubasi. Malformasi: gelerobung meliputi mata, ttcleft palatett, paruh atas dan bawah yang tidak cunbuh dengan sempurna, micromelia, syndactyli dan ectrodac-tyli.
Gambar II: Embryo ayam umur 15 hari yang diinjeksi dengan 0.04 mg Endoxan-Asta pada umur 5 hari inkubasi. Malformasi: kelopak mata tidak tumbuh sempurna, micromelia dan ectrodactyli.
Gambar III: Embryo ayam umur 13 hari yang diinjeksi dengan 0.04 mg Endoxan-Asta pada umur 4 hari inkubasi. Malformasi: exencephali, paruh atas tidak tumbuh, mata yang tidak tumbuh dan ectopia viscerum.
Gambar IV: Embryo ayam umur 16 hari yang diinjeksi dengan 0.04 mg Endoxan-Asta pada umur 4 hari inkubasi. Malfor-masi: paruh atas sisi lateralnya bercelah, paruh bawah pendek, ectrodactyli (jari kaki ke I hilang).
Gambar V: Embryo ayam umur 13 hari yang diinjeksi dengan 0.04 mg Endoxan-Asta pada umur 5 hari inkubasi. Malformasi: kelopak mata tidak tumbuh, paruh atas tidak tumbuh sempurna, micromelia, syndactyli, ectrodactyli dan ectopia viscerum.
Gambar VI: Embryo ayam umur 14 hari yang diinjeksi dengan 0.04 mg Endoxan-Asta pada umur 4 hari inkubasi. Malformasi: gelembung meliputi mata kanan, paruh atas dan bawah tidak tumbuh sempurna, micromelia, jari kaki kanan melengkung ke dalam dan ectrodactyli.
Gambar VII: Embryo ayam umur 16 hari yang diinjeksi dengan 0.05 mg Endoxan-Asta pada umur 5 hari inkubasi. Malformasi: kelopak mata tidak tumbuh, paruh atas dan bawah tidak tumbuh sempurna, micromelia dan ectrodactyli.
1t
rl
\
li
Gambar vrrr: Enbryo ayam unur 15 hari yang diinjeksl dengan 0.04 ng Endoxan-Asta pada r:mur 5 hari lnkubasi. Malformasi: kelopak nata tidak tumbuh sempurna, ectopla viscerum sampai wilayah jantung, syndac_ It ty11 dan bulu tidak berkenbang.
\
Ganbar IX: Enbryo aya:n diinj eksi unur 4 hari unur 16 harl dart seri kontrol- yang dengan aquabi"dest sebanyaft 0.2 cc pada inkubasi.
Gambar X: Rangka embryo ayam umur 16 hari dari seri kontrol. Diwarna dengan Alizarin Red S.
ていることというとうというとうというというというというというとはないますっというというとなるないないとはないというというというというというというというというというというというというという
_/r.
Ganbar XI: Rangka embryo ayam umur 15 harl ya4g diinjekst dengan 0.04 nS Endoxan-Asta pada umur 4 hari lnkubasi. Malforrnasi: paruh bawah yang tidak tr:mbuh dengan sempurna dan micromella. Tanpak tulang tarso-metatarsus yang tereduksl dan nelengkung. Pewarnaan dengan All-zarin Red S.
Ectopia viscerum
- : Viscera terbuka sampai wilayah hati (Gambar V)
- Viscera terbuka sampai wilayah jantung (Gambar VIII)
Exencephali (Gambar III)
"Cleft palate"
Di samping malformasi tersebut di atas didapatkan juga embryo-embryo yang mengalami edema dan pendarahan.
Tabel 1: Frekwensi malformasi pada embryo ayam yang dapat hidup sesudah 9 hari inkubasi setelah disuntik dengan Endoxan-Asta ke dalam kantung yolk pada umur 4 dan 5 hari inkubasi.
| 22222222222222222222222222222 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Hari | 4 hari | 5 hari | ||||
| Dosis | 0.04 mg | 0.04 mg | ||||
| Malformasi pada: | ||||||
| Mata: - Gelembung meliputi mata - Kelopak mata tidak tumbuh - Mata tidak tumbuh | 3 1 1 | 3 4 0 | ||||
| Paruh | 9 | 18 | ||||
| Micromelia | 5 | 6 | ||||
| Digit | 10 | 10 | ||||
| Ectopia viscerum | 16 | 9 | ||||
| Exencephali | 5 | 2 | ||||
| "Cleft palate" | 2 | 3 | ||||
| Edema | 1 | 8 | ||||
| Pendarahan | 4 | 1 | ||||
| Catatan: | ||||||
| Jumlah telur Jumlah yang abnormal Jumlah yang normal | 137 30 9 | 106 26 10 | ||||
| Jumlah yang mati seBelum 10 hari ini basi | 98 | 70 | ||||
Malformasi yang paling sering didapatkan adalah kelainan-kelainan pada paruh, digiti dan ectopia viscerum. Dalam keada-an yang parah sekali, viscera dapat terbuka sampai wilayah jantung. Ectopia viscerum dijumpai pula dalam seri kontrol, tiga kejadian dari 53 telur.
Jumlah macam anomali per embryo yang cacat, dengan anomali lebih dari dua macam, untuk yang disuntik pada umur 4 dan 5 hari inkubasi tidak mengalami perbedaan, yakni 3.8 per embryo (Tabel 2 dan 3).
Tabel 2: Embryo ayam yang memperlihatkan lebih dari dua macam anomali sesudah diinjeksi dengan 0.04 mg Endoxan pada umur 4 hari inkubasi.
| DII8 | DII | II, | J | K | MI12 | Total | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Embryo | 11 | 4 | 23 | 23 | 13 | 6 | |
| Malformasi: | |||||||
| Gelembung meliputi mata | + | ||||||
| Kelopak mata tidak tumbuh | İ | + | |||||
| Mata tidak tumbuh | +. | • | |||||
| Paruh | + | + | + | ||||
| Micromelia | + | ٠ | |||||
| Digit . | + | + | + | + | + | ||
| Ectopia viscerum | ļ | + | + | + | + | ||
| Exencephali | + | + | + | + | |||
| "Cleft palate" | | + | + | |||||
| Edema | |||||||
| Pendarahan | + | ||||||
| Jumlah macam anomali | 3 | 5 | 4 | 5 | 3 | 3 | 23 |
Hasil pewarnaan rangka dengan Alizarin Red S membuktikan, bahwa dalam keadaan micromelia, maka tulang yang tidak tumbuh sempurna adalah tarso-metatarsus. Selain pendek sekali juga seringkali melengkung (Gambar XI).
Syndactyli umumnya berlangsung antara digit ke III dan IV. Anomali ini hanya terbatas pada indentasi yang tidak sempurna pada waktu pertumbuhan berlangsung. Tulang-tulang phalanx yang menyokong masing-masing digit tersebut tetap terpisah.
Tabel 3: Ernbryo ayan yang memperlihatkan lebih anomali sesudair diinjeksi dengan 0.04 umur 5 hari inkubasi. dari dua macam mg Endoxan pada
| E Db r y o | Err | Frr | F' | Gr | G, | H, | H, | L, | L, | Lr | Lrt 28 | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| "L | "10 | '5 | 'r7 | '2o | 'B | ^r1 | '2o | '22 | ||||
| Geleubrrag @llputl uta | ||||||||||||
| tldrk Kelopak [ata trnbuh | ||||||||||||
| Mata tldak tuduh | ||||||||||||
| Pauh | ||||||||||||
| t'l1cr@1ls | ||||||||||||
| D1glt | ||||||||||||
| Ectopla vlacer@ | ||||||||||||
| Exeucephall | ||||||||||||
| palate" "Cleft | ||||||||||||
| Edeu | ||||||||||||
| Pendarahan | ||||||||||||
| uac& s@a1l J@lah | 36335453433 |
Dalam hal ectrodactyli didapatkan kenungkinan, bahwa digit ke I atau ke II atau ke IV yang hilang. Dalan penelitlan yang dilakukan sekarang ini dijuurpai pula embryo yang digit ke II, III dan IV hilang sekaligus. Mengenai ectrodactyli ini tidak dapat dikatakan digtt mana yang lebih mudah hilang. Selain darl ltu Juga tldak didapatkan adanya simetri daripada anomali iul antara kakt klri dan kanan. Tingkatan (degree) hilangnya diglt Juga tidak sama. Ada yang seluruh digit hil-ang samaseka-1i., ada Juga yang terbatas pada beberapa phalanx saja.
Dlgit yang uemperlihatkan salah arah, disebabkan oleh pertumbuhan digit yang membelok ke luar alau ke dalam. Dalan keadaan normal, arah tumbuh adalah lurus menurut sunbu 1-ongltudinal digit.
Embryo yang cacat dengan macam-macam anomal-i yang kebanyakan dapat hldup hlngga r:nur l-6 hari adalah dari embryo yang diirrJeksi dengan Erdoxan pada umur 5 hari inkubasi-. Dari berat badannya, jika dibandingkan dengan embryo-embryo seri koutrol, jelas tanpak adanya penurunan bera.t badan yang menyolok (Tabel 4). Ini membuktikan adanya pertumbuhan menyeluruh yang terhanbat (stunted growth).
Tabei 4: Berat embry(r ayanr p:rrla umur 16 hari sesudafr diinjeksi dengan [ndoxan*Asta ke da]-am kantung yolk pada hari inkutrasi ke-5 dengan dosis 0.04 mg per telur dibandingkan dengan seri kontrol.
| Dosis / telur | Eksper imentil 0.04 mg Endbxan | Kontrol 0.2 c.c aquabidest | |||||
| 5 hari | |||||||
| dalam gram Berat urnur 16 hari | 2.9408 3.5850 4.2798 4.5329 4.967 8 5.3910 5.9245 | 7 .3984 8.8710 9 .5963 10. 2560 11. 3949 12.8025 13. 6819 | |||||
D ISKUSI
Penelltlan ini urembuktikan, bahwa Endoxan-Asta bl1a dllnjekslkan ke dalan kantung yolk enbryojernbiyo ayam umur 4 dan 5 harl inkubasi nenghasilkan cacat pada: mata, paruh, kaki, dlgit, langit-J-anglt trulut. Selain ltu dapat pula menyebabkan ectopla vlscerus, exencephall, pertumbuhan keseluruhan yang terhambat, edema dan pendarahan.
Salzgeber (L972) melakukan penelitian terhadap pengaruh 'rnltrogen mrstardrr pada pertumbuhan embryo ayam dengan Jalan nengapllkaslkannya pada umur 3 dan 4 hari 1nkubas1. Didapatkannya, bahwa sayap dan kaki kedua-duanya sangat tereduksi atau hllang samasekali. Urutan hilangnya bagian-bagl-an rangka ekstrimitas sangat teratur, yakni: flbula, tlbla, metatarsal untuk kaki dan radlus, metacarpal untuk sayap. Bagl-an proximal, sepertl femur dan humerus tetap ada dan yang paLlng sedikit mengalani perubahan-perubahan dibandingkan dengan segmen-segmen lalnnya.
Cyclophosphanide yang dalan studi.-studl kllnis nenlllkl suatu spektrum aktivltas antitumor yang dalan banyak hal- mlrip dengan "nltrogen mustardrr dalarn penelltian lnl rnenperllhatkan perbedaan kerJa sebagal berikut:
Reduksi daripada baglan-baglan ekstrlmitas hanya dlJunpal pada kaki. Sayap sanasekali tidak dtpengaruhl pertunbuhannya oleh cyclophosphanlde.
Untuk rmur yang sama pada waktu zat diaplikasikan, yakni umur 4 hari inkubasi, "nitrogen mustard' menyebabkan phocomelia, sedang cyclophospharnlde hemirnelia (reduksi dari bagianbagian distal ekstrinitas) .
Tulang panjang yang lebih kurang tidak dikenai pengaruh "nitrogen mustardrr adalah tulang femur. Pada cyclophospharnide tuJ.ang-tulang femur, tibia dan fibula mer:upakan tulang-tulang yang tahan terhadap pengaruh zat tersebut. Sedang tulang tarso-metatarsus, serta phalanx merupakan bagian-bagian yang peka terhadap pengaruh cyclophospharnide. Oleh kareua itu pada keadaan nicromelia, tulang tarso-metatarsus tampak sangat tereduksi. Dalam ha1 ectrodactyli, junlah phalanx pada suatu digit dapat tereduksi atau tidak tumbuh sarnasekali-,
Walaupun hasil teratogenesitas oleh cyclophosphamide tergantung tidak hanya pada species, tetapi juga "straint' dari hewan-hewan percobaan (Gibson dan Becker, 1968), malformasi yang ditinbulkan oleh cyclophospharnide pada ayam dibandingkan dengan pada mencit dan titus, memperlihatkan persamaan. Anomall, pada kepala, seperti exencephali, mata terbuka karena kelopak mata yang tidak tumbuh seupurna dan "cleft palate" pada tikus (Chaube et aL., 1967) , dijurnpai pula pada ayam. Pembentukan dlgit yang tidak serrrpurna pada mencit (Cibson dan Becker, 1968) dan tikus (Chaube et aL., 1967) seperri syndactyli, ectrodactyli dan adactyli, dapat pula dijumpai pada ayan. Ectopia viscerum yang merupakan anomali yang sangat sering dijunpai pada embryo ayam, tldak pernah dilaporkan oleh kedua peneliti tersebut pada mencit maupun rikus yang tliperlakukan dengan cyclophosphamide.
RINGKASAN
- 1. Telah diteliti pengaruh Endoxan-Asta (cyclophosphamide) pada pertumbuhan embryo ayam umur 4 dan 5 irari inkubasi dengan nenginjeksikannya ke dalam kantung yol.k.
- 2. Dosj.s 0.04 urg per telur merupakan dosis teratogernik,
- 3. Malformasi yang dapat ditinbulkannya adalah: gelembung meliouti mata, kelopak mata yang tidak tumb'rh sempurna, mata yang tidak tumbuh samasekali, paruh dengan sisi lateral yang bercelah, paruh bawah afau paruh atas yang pendek, paruh menyilang, micromel-ia, syndactyli, ectrodactyli, ecfopia viscerum, exencephali dan "c1eft palare".
- 4. Pada keadaan micromelia, tulang tarso-metatarsus merupakan bagian yang sangat tereduksi.
- 5. Endoxan-Asta hanya berpengaruh terhadap pertumbuhan ekstrimitas belakang dan bersifat hemirnelia.
- 6. Si.fat anomali pada ekstrimitas tidak simetris dan tingkatannya juga tidak sana.
7. Endoxan-Asta berpengaruh rnenghambat pertumbuhan pada umunnya.
UCAPAI.I TERIMA KASIH
Penulls rnenyarnpaikan terima kasih kepada Badan Rlset-ITB yang telah menbantu membiayai penelitian ini. Juga kepada Perpustakaan t'Hubrecht Laboratorium" di Utrecht-Nederland ya:ng telah membantrr menglrimkan kopi dari tulisan-tulisan yang menunjang penelltian ini, penuJ-ls menyampaikan penghargaannya.