Etude Par Fragmentographie de Masse de la Cinetique Sanguine D

FRAGMENTOGRAPHIE DE MASSE

L'essentiel des travaux en ce domaine concerne le couplage chromatographie en phase gazeuse et spectrometrie de masse CG/SM. Cette technique est actuellement la seule méthode d'analyse capable de fournir des informations structurales précises sur de composés non isolables à l'état pur.

Dans la technique de dosage en CG/SM, on compare les intensités de deux ou plusieurs signaux correspondant les uns à la substance dont on désire connaître la concentration, les autres au standard dont la concentration est connue. Le dosage par cette méthode de l'étalon interne implique la détection de plusieurs ions.

Cette méthode largement utilisée et est connue sous le nom "fragmentographie de masse".

Un schéma du couplage CG/SM utilisé pour la fragmentographie est présenté dans la figure 1.

Le fragmentogramme est obtenu au cours de l'élution chromatographique et ressemble très exactement à un chromatogramme gazeux.

En conséquence, si la spécificité de la fragmentographie de masse est fonction du choix des ions fragments choisis, il est évident que cette spécificité est également fonction du pouvoir de séparation du dispositif chromatographique.

• 1. chromatographie en phase gazeuse
• 2. séparateur moléculaire
• 3. source d'ions
• 4. aimant
• 5. multiplicateur d'électron
• 6. spectre de masse
• 7. tracé de la chromatographie
• 8. fragmentogramme de masse

Fig. 1 Schema du couplage CG/SM

En général une étude par fragmentographie se deroule selon le schéma suivant:

• * mise au point de la technique d'ext action et d'isolation du médicament à partir des liquides biologiques.
• * dérivation du composé pour ameliorer sa stabilité et son comportement en chromatographie en phase gazeuse.
• * choix de la meilleure colonne et des meilleures conditions pour une separation optimum. A ce sujet, les colonnes capillaires de verre sont celles qui fournissent les meilleurs résultats.
• choix d'un étalon interne adéquat pour le dosage.

Le succés d'une étude par fragmentographie de masse réside en partie dans le choix des ions sélectionnés.

Ces ions doivent être caractéristiques des composés et doivent être de préferénces des ions intenses.

En principle donc, l'ion à sélectionner en priorité sera celui donnant le pic de base. Malheureusement pour des composés de poids moléculaires élevé cet ion se situe vers les faibles masses et n'est pas caractéristique du composé. On choisira dans ce cas un ion moins intense mais de masse plus élevée.

Etalonnage

Le dosage du composé nécessite l'établissement préalable d'une courbe d'étalonnage. Cette courbe donne le rapport de la surface ou de la hauteur en fonction de la substance à doser. Cette courbe est construite à partir de solutions dans lesquelles la concentration en étalon interne est constante et celle de la substance à doser variable.

Etalon interne

Lorsqu'on utilise l'étalon externe dans la mesure, la précision peut se trouver diminuée du fait de la non reproducibilité des conditions opératoires. Ce n'est pas le cas lors de l'utilisation d'un étalon interne.

L'étalon interne idéal sera celui dont:

• la structure ou le comportement chromatographique sera voisin de celui du composé étudié.
• les propriétés physicochimiques et le modèle de fragmentation se rapprocheront le plus de ceux du produit à doser.

Il apparait ainsi que cet étalon interne idéal est le produit marqué par des isotopes stables. L'utilisation de molécules marquées non radioactifs, de l'hydrogéne, du carbone, de l'azote de l'oxygéne et du soufre pour des études biomédicales connait une importance croissante qui va de pair avec l'existence de l'équipement ndcessaire a leur detection et leur mesure CC/SM dans un nombre de laboratoires.

Pour cela il doit remplir deux conditions:

• etre d'une purete isotopique dlevee
• oossdder un nombre d'atomes de deuterium, de carbone l3 ou d'azote l5 iup,iriuer i deux afin d'tjviter les interfdrences avec le produit naturel qui prtisente un anlas isotopique a M. lt'l+1. M+2.

PRESENTATION DU F_I594

Le F- I 594 est un produit synthetise au sein du centre de Recherche Pierre Fabre qui a une action anti inflammatoire et possdde des proprietes antalgiques et antipyretiques superieures a celles de I'acide acetyl salicylique. Cette moldcu- !e est connue sous le nom "METBUFEN".

Des mises au point recentes (BRET 1980) exposent en detail I'etude pharmaconcindtique en utilisant le moldcule marqude du F- 1594 au carbone 14. Les cinetiques d'elimination ont dti suivies par des ccirnptages de radioactivitd au niveau de sang, urines et f'dces ri l'aide de 1a spectromdtrie en scintillation liquide.

Cette experience montre que le taux maximum de radioactiviti est atteint rapidement au bout de 2 :i 4 houres anrbs I'administration du produit.

Formule: \[H \ CH_3\] \(- C - C - C - C - C\) \(OH\) \(OH\)

Acide-p-biphenyl-4, oxo-4. methyl'2-butyrique.

ETUDE DU SPECTRE DE MASSE DU F-I594

Le spectre de masse du F 159.1 (fig. 2) presente un ion moldculaire a mlz 268 relativcment abondant. Lc pic de base du spectre se situe h m/z I 8 I . Malheureusement, le F- 1594 presentant une fonction acidc ne peut etre detecte en chromatographie en phlse gazeuse.

Une derivation prealable est necessalre.

Nous avons essayt! une derivation en estdrifiant par le diazomethane. Cette techniqLre permet d'esterilier rapidement les fonctions acides libres sous forme d'esters mdthvlioues.

La technique de dérivation proposée, nous a permis de doser facilement le F 1594, mais il faut signaler que dans l'étude de la cinétique sanguine chez l'homme, le bruit de fond du plasma humain est différent de celui du plasma de rat et nous avons constaté qu'il y avait dans le plasma humain des composés donnant des ions aux masses m/z 282 et 260, ces composés ayant en outre le meme temps de rétention que le F 1594 et que l'étalon interne; ce qui peut entrainer des interférences surtout pour les concentrations faibles en F 1594 en particulier pour les temps longs.

En conséquence, nous avons éssayé un autre dérivé pour éviter les interférences avec ces impuretés; il s'agit du dérivé éthylé. (fig. 2). La préparation de ce réactif est très simple, en plus, il est moins toxique que le diazométhane.

Fig. 2 Spectre de masse du F-1594 et du F-1594 éthylé

En fragmentographie de masse, bien que la purification soit pousée, nous n'avons pas retenu l'ion moléculaire à m/z 296, car il est toujours présent dans l'extrait plasmatique, de même que les ions à m/z 251 et m/z 181.

Nous avons donc choisi de détecter sélectivement l'ion fragment de masse 250 de ce composé.

Cet ion de masse à m/z 250 correspond à l'ion:

\[\text{[rumus tidak dapat ditampilkan dengan baik — lihat PDF asli]}\]

Choix de l'étalon interne:

Nous disposions, pour ce dosage, du F-1594 bideutérié.

Malheureusement ce composé n'a pu être utilisé pour l'analyse quantitative car c'était un mélange de F-1594 bideutérié, monodeutérié et non marqué comme le montre son spectre de masse dans la figure 3.

Fig. 3 Spectre de masse du F--1594 bideuterie et du F-1594 bideuterie methyle.

Dans un tel cas, la courbe d'étalonnage ne passe par l'origine des coordonnées (fig. 4).

En outre, il s'agit là de l'inconvénient majeur, on ne peut détecter de très faibles quantités du produit à doser à cause du recouvrement du pic à m/z 282 par l'impureté.

Nous avons donc du choisir un autre étalon interne.

Notre choix s'est porté sur une molécule voisine du F-1594 possédant également diphényle: le R-III-222 (l'acide p-biphényl-4-chloro 2'-acétique).

Fig. 4 Courbe d'etalonnage du F-1594 in uitro (e.i. F-1594-Dz)

Le spectre de masse de ce composé et celui de son dérivé éthylé utilisé dans le cas de l'étude pharmacocinétique chez l'homme sont présentés dans la figure 5.

Le pic moléculaire de ce composé à m/z 274 à été retenu pour l'analyse en fragmentographie de masse.

Fig. 5 Spectre de masse du R-III-222 et du R-III-222 éthylé

Le comportement en chromatographie gazeuse du F-1594 et du R-III-222, tous deux sous forme de dérivés éthylés a été étudié. Un chromatogramme est présenté dans la figure 6.

La colonne utilisée est une colonne capillaire de verre type SE 30 de 25 m de long et 0,23 mm de diamétre.

Là température du four était de 223° C.

L'étude d'extraction du F-1594.:

Nous avons dans un premier temps essayé une méthode d'extraction à l'aide du produit F-1594 marqué au C-14.

Le rendement d'extraction est constant sur l'intervalle de consentration étudié et égal à 90 %.

Le shéma de l'extraction est présenté sur le tableau 1.

Etablissement des courbes d'étalonnage.

Le dosage d'un composé par fragmentographie de masse implique l'établissement préalable d'une courbe d'étalonnage.

En toute rigueur, ces solutions étalons doivent être préparées à partir du milieu biologique dans lequel on doit doser le médicament.

Ainsi dans le cas de notre étude, la courbe d'étalonnage présentée ci-après (figure 7) a été effectuée apres extraction à partir du plasma humain de quantites connues et variables de substance à doser et de quantités connues et constante d'étalon interne.

Le fragmentogramme représentant les pics des ions du composé à doser et de l'étalon interne sélectionnés pour l'analyse est présenté dans la figure 8.

ETUDE CINETIQUE DU F-1594 CHEZ L'HOMME

L'étude pharmacocinétique du F-1594 chez l'homme a été réalisée après administration par voie orale en prise unique de 200 mg.

Les prelèvements sont faits à partir d'une demi heure, puis après 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3, 5; 4; 6; 8; 24; et 48 heures.

Fig. 6 Le comportement chromatographique du F-1594 et du R-III-222 éthylés

Tableau 1 Schema d'extraction du F-1594 par l'éthanol

Les echantillons de sang sont recueillis dement possible apres les prdlevements. sur hdparine et centrifugds le plus rapi-

Fig.7 Courbe d'etalonnaqe du F I594

Fig.8 Fragmentogramme du F-1594 et du R111,222

RESULTATS

Après extraction par l'éthanol, éthylation et prépurification en CCM, les échantillons sont analysés en fragmentographie de masse.

Les ions retenus sont ceux à m/z 250 pour le F-1594 et m/z 274 pour l'étalon.

Le calcul de la concentration du produit à doser dans chaque échantillon est effectué en faisant le rapport de la hauteur de ces pics et en se rapportant à la courbe d'étalonnage.

Les résultats obtenus sont présentes dans le tableau 2 et les courbes cinétiques sanguines à la figure 9.

La concentration maximale qui varie de 7,25 à \(12,20/\mu g/ml\) est atteinte entre 2,5 et 3,5 heures après l'administration.

Les paramètres pharmacocinétiques sont regroupés dans le tableau 3.

Selon le calcul, la valeur moyenne de la demie vie biologique est de l'ordre de 23,5 heures; le volume de distribution est de 97,6 litres et la clairance plasmatique totale est de 2,78 L.h^-1. en supposant totale la resorption du F-1594.

Tableau 2 Etude de la cintique sanguine du F-1594 apres administration par voie orale

Note: *) Concentrations maximales dans le plasma (µg/ml)

Fig. 9 Courbe de la cinetique sanguine du F-1594 (méthode éthylation)

Tableau 3 Parametres pharmacocinetiques du F-1594

k_a = constante d'absorption t_a = demi vie biologique

= volume de distribution

Cl = clairance ASC = aire sous la courbe

CONCLUSION

Nous avons au cours de ce travail appliqué la techniqué de fragmentographie de masse au dosage chez l'homme de molécule médicamenteuse le F-1594.

Cette méthode très spécifique et très sensible nécessite une extraction et une séparation préalable des composés à analyser.

Le choix de la méthode d'extraction est un facteur important dans cette méthode de dosage. Cette extraction doit être reproductible, la plus spécifique possible afin de minimiser les risques d'interférences avec d'autres composés, et si possible d'une réalisation assez facile pour permettre des analyses de routine.

La séparation des composés, autre facteur important de cette technique de dosage, a été réalisé en chromatographie gazeuse sur colonne capillaire.

Malheureusement cette excellente technique de séparation nécessite souvent une dérivation préalable des composés soit pour augmenter leur volatilité soit pour accroître leur stabilité thermique.

Une dérivation a été nécessaire pour permettre le dosage du F-1594.

La dosage par fragmentographie de masse fait appel à l'utilisation d'un étalon interne, ce dernier evant être extrait et chromatographié dans des conditions aussi proches que possible du produit à doser.

Les analogues marquées avec un isotope stable dont nous disposions, ne présentant pas une pureté suffisante, neus avons du chercher des molécules voisines de celles à doser.

Le dernier facteur important dans la mise en oeuvre de cette technique est le choix des ions devant etre enregistres. Ces ions, nous l'avons vu, doivent être aussi intrenses que possibles afin d'obtenir une grande sensibilité et spécifiques.

La sensibilité et la specificité de la fragmentographie de masse en ont fait une methode particulièrement adaptée aux études pharmacocinétiques chez l'homme.

Cette technique, si elle n'nest pas encore routinière est en pleine expansion et le progrès réalisé dans le couplage HPLC. SM d'une part, et l'utilisation croissante des isotopes stables dans le domaine biopharmaceutique d'autre part vont encore accroître le champ de ses applications.

Remerciement

Que messeurs le Professeur J. L. CHANAL, le Professeur R. MARIGNAN et monsieur M. AUDRAN, Maitre-Assistant au Laboratoire de Physique de la Faculté de Pharmacie (Université de Montpellier I, France) qui ont collaboré ce travail, trouve, ici. l'expression de nos vits remerciements.

BIBLIOGRAPHIE

• BEYNON, Mass Spectrometry and its Application to Organic Chemistry, Elsevier publishing et Cie. Amsterdam London New York. Prenceton, 1960.
• BRET M.C., These de Doctorat es Science Pharmaceutiques de Montpellier. France, 1980.
• 3. CAMISH Me., European Journal of Mass Spectrometry in Biochemistry medicine and environmental research, 1980, vol 1, no. 1, 7–31.
• 4. WANGSAATMADJA II., Thèse de Doctorat de 3 eme cycle, Fac, de Pharmacie de Montpellier, France, 1981.