I Pendahuluan
Pada saat ini di Indonesia cukup banyak beredar scdiaan obat yang mengandung zat aktif antidepresan turunan amin trisiklik, baik yang berisi zat tunggal nraupun dalanr kombinasi dengan senyawa psikotropik lain seperti perfenazin, flufenlzin, diazcpam dan klordiazepoksida.
Bcrbagai cara penentuan kadar senylrva antidepresan aniin trisiklik, baik untuk pencntuannya dalarr sediaan nlaLrpLrn dalanl cairan biologis untuk kclterlLran purgcndllian nutu obat tlan perneriksaan klinis, telah tlikcnrbangkan oleh para pcneliti terdaltulu (1,2). Cara analisis yang sudah dikenrbangkan lerscbut nrcncnkttp cara yang seclerhana. seperti spe ktrofotomctri. sirnl\rr cf,rr yrng nrelibrtkan peralatan analisis yrng nrodern scperti kromatografi gas (3.4) dan krornatogrirfi cair penarrpilan tinggi (5, 6, 7, 8, 9).
Cara analisis yang sr.rdah dikembangkan di suatu laboratoriunt tidak selalu dafat diterapkan cli laboratoriunr lain karcna nrasalah peralatan dan pereaksi yrrrg tersedJa. Olch karena itu perlu dikenrbangkan ntetode analisis yang sc:uli tlengan kondisi laboratorilrnr yang ada untLrk tujuan analisis yang drhadepi. I'rda pcnclitian tcrdalrulLr telah dikerrrbangkan metode analisis betrerapa sen!'r\al !lntidepresan trisiklik derrgan clra krontatografi lapis tipis (KLT) chn spektrototornetri. Cura ini rnnsilr nrenriliki beberlpa kclr,':tia)tan. khLrsrrsnya drllnr hul yrenyiapan sanrpel lekstraksi) dan batas kepckaan rletodc analisis. L)alanr pcnclitian :ni dikenrbangkiln suatu cara penclttuilD kadar beberapa s!.nyawr antideprcsan trrnlnan amin trisiklik 1'ang penrisahannlr lrcnggunakan kronratografi lap:s tipis, sedatlgkall penentuan kLrantitatif dilakLrkan dengan cara spcktrofotodensitometri.
Tujuan penelitian ini terutanla uutuk ntendapatkan nrctode penentuan kadar sen) awa terscbut, baik dalanr sedilln nraupun dalant sar.npcl urin.
2 Bahan dan alat
2.1 Bohon
St'nyawa amin trisiklik munri: arnitriptilin hidroklorida (Roche), ilnipranrin hidroklorida (Ciba Geigy), dan nortriptilin hidroklorida (Squibb); beberapa sediaan tablet yang mengandung zat aktif tenebut; pelat lapis tipis silika gel 60, E. Merck 20 X l0 cm; metanol dan eter berkualitas pro analisa; pereaksi kimia lain.
2.2 Alat
Bcjana kronratografi untuk ukuran pelat 20 X 20 cm;spektrofotodensitonteter Shinradzu type CS-910.
3 Percobaan
3.I Ekstaksi
3.1.l Untuk tablet
Satu tablet dimasukkan ke dalam vial l0 ml, kemudian ditambahkan air 2 ml. Vial digetarkan dengtrn ultrasomc sampai tablet hancur, tambahkan 8 ml nretrnol tlan isi vial dikocok selanra lt'bih kurang satu nrenit. Bahan pembawa tablet yang tidak lanrl dibiarkan nrcngendap dalt supcrnatan diarnbil untuk krorlltografi.
-1.1.2 Untuk uritt
LimapulLrh ml urin dirlasukkan ke dll:rm corong pisah berkapasitas I25 tnl. Urin dibrsakln dengln pcnlntbuhan lntoniak prklt (l5ii) sanrpai pH 9-10. kenrudjun cliekstrrksi dLra kali masing-nrasing dcngan l0 nrl eter (l,cnlrocokan dilakuk:rn dengan tangur kire-kira l0 rnenit).
Irasc eter cliktrntpulkan dalam gelas piala 50 url hlLr diuapkan di atas pcnangas air sanrpai kering. RcsiclLr dilanrtkln kcntbrli dalanr satLr nrililiter Inctanol. kerrrtrJi:rrr,lillkrrkrrr kro tlrJ logrJ li.
3.2 Kr0matografi
Tcrhadap larurtan zrt rrlurni atau ckstrak, tlilakrrkan krontato-erali sebagai bcrikut: s:ltu nrikrolitcr larutan ditotolkan pada pchr lapis tipis ilcngan jlrak satu sentir eter clari sisi bawah. dibierkrn sanlpJi kcring. kcntLrdian dielusj sejilujl I rnl. PclJt dikeringkan Padt sul)u kr:nrr. kentrrrlian diukrrr secrra spektrolbtodcnsitoltctri. Fasc gcrtk l ang dipakai atJallh nlctalol.
3. 3 Spektrofo todcnsitometi
Noda plda pclat KLT diukLrr secara sp!'ktrofotodensitonrctri dengan spcktrofotodcnsitorncter SltintlclzLr CS-910. Pcrrgukurun dilakukan dcngalt Inetodc lirir.r slrketrolotonretri UV singk vatclcngtlr pada panjang gelornbang 240 nrn. Kccepatan pengukuran (scaning) diatur patla kecr-patan 20 mnr,/rnenit dan sensitivitas alat (rckordc'r) diatur pada "X2".
3.4 Perhitungan kador
Perhitutrgirn kadar senyarva antidcpresln anrin trisiklik (scblgai seny3',va Lrtuh) dalant sanrpcl tablet n)aupun clalant slntpel urin dilakukan dengan rnenrakli kurva klljberasi. Kurva kaliberasi dibuat dcngan cara menotolkan Iarutan zat murni rlalam rnetanol, dalant konsentrasi yang bcrvariasi, pada pcll.t yang kemudiln dilakukan krontatografi dan spektrolbtodensjtornetri.
Kurva kalibcrasi yang tlihasilkan untLrk rnasing-nrasing senyawa yang tlicoba pilda percobarn ini dapat dilihat pada ganrbar 1,2. rlan 3.
Gambar 1 Kurva kaliberasi untuk amitriptifin, dengan persamaan garis regresi: \(y = 6.45 \times + 1.43\) dan koefisien korelasi = 0,999, dengan x adalah kadar zat (dalam \(\mu\)g) dan y adalah tinggi puncak (dalam cm).
Gambar 2 Kurva kaliberasi untuk imipramin, dengan persamaan garis regresi: \(y = 3.71 \times + 0.52\) dan koefisien korelasi = 0.996.
Gambar 3 Kurva kaliberasi untuk nortriptilin, dengan persamaan garis regresi: \(y = 4,48 \times 1,90\) dan koefisien korelasi = 0,996.
4 Hasil percobaan dan Pembahasan
4.1 Ekstraksi dari urin
Dengan menggunakan eter sebagai pengekstraksi, penguapan pelarut relatif lebih cepat dan ekstraksi ketiga senyawa amin trisiklik yang dicoba cukup kuantitatif. Jumlah penemuan kembali (recovery) zat dari sanlpel urin dengan prosedur ekstraksi ini adalah 89% untuk imipramin, 109% untuk nortriptilin, dan 75% untuk amitriptilin, dilakukan secara ilr l,irr.r. Untuk rnengcnrbalikan konsentrasi zat dalam ekstrak akhir ke konsentrasi dalam urin, maka angkaangka tersebut harus diperhitungkan karena kurva kaliberasi dibuat dari larutan zat mumi yang tidak melalui ekstraksi. Dalam penelitian ini pernah dicoba pelarut kloroform sebagai pelarut untuk ekstraksi; pelarut ini biasa dipakai untuk ekstraksi senyawa-senyawa organik dalam fase air. Penggunaan pelarut klorofbrm dalam prosedur ekstraksi percobaan ini ternyata serrng menimbulkan masalah, yaitu sering terbentuknya emulsi yang sukar menrisah pada pengocokan.
4.2 Kromatografi
Pada penelitian terdaltulu dipakai pelarut campur untuk fase gerak kromatografi, sedangkan dalarn penelitian ini digunakan pelarut tunggal metanol yang ternyata memberikan pemisahan yang cukup baik dan sempufna dari noda senyawa lain yang mungkin mengganggu. Karena penggunaan pelarut tunggal ini. fas!' gerak bisa dipakai lebih lama (cukup stabil), tidak perlu mencampur pelarut untuk fase gerak dan reprodusibilitas kronratografi menjadi lebih baik.
Dengan kondisi kromatografi ini harga Rp untuk masing-masing senyawa adalah 0,33 untuk amitriptilin dan imipramin, dan 0,14 untuk nortriptilin.
4.3 Analisis kuantitatif
Penggunaan cara spektrofotodensitometri untuk analisis kuantitatif noda-noda yang dihasilkan dalarn kromatograti memberikan beberapa keuntungan dibandingkan dengan metode sebelumnya, antara lain: (a) tidak perlu mengerok noda dari pelat dan mengekstraksi kembali senyawa yang diperiksa, dan (b) dapat mengurangi kesalahan yang mungkin terjadi pada waktu pengerokan noda dan ekstrasi kembali. Denplan denrikian cara analisis rnenjadi lebih praktis dan lebih reprodusibel.
4.4 Kepekaan metode analish
Uji batas kepekaan alat spektrofotodensitometer yang dilakukan terhadap larutan senyawa murni yang dikrornatografi menunjukkan bahwa jumlah terkecil yang masih dapat diukur secara kuantitatif pada kondisi pengukuran
seperti telah disebutkan di muka adalah sekitar 100 ng untuk amitriptilin dan nortriptilin dan 300 ng untuk imipramin. Kalau dikembalikan ke cara ekstraksi dan kromatografi, dari metode analisis ini dapat dihitung bahwa konsentrasi senyawa amin trisiklik terkecil dalam urin yang msih dapat diukur dcngan rnetode ini adalah sckitar 2 ug/ml urin untuk amitriptilin dan nortriptilin, dan sekitar 6 ug/nrl urin untuk inlipramill. Untuk kcperLran analisis yang lebih peka lagi, beberapa hal tersebut di bawah ini dapat disesuaikan lagi, yaitu (a) mengurangi volume pelarut (metanol) untuk melarulkan kembali residu hasil ekstrasi, (b) memperbanyak jumlah ekstrak yang ditotolkan pada waktu kromatografi (rnisalnya sampai l0 pl), dan atau (c) mengatur kepekaan alat spektrofotode nsitonleter.
45 Reprodusibilitas
Reprodusibilitas mctode analisis ini telah dicoba dengan menentukan kadar senyawa amin trisiklik dalam beberapa sampel urin dengan konsentrasi yang sama. Konsentrasi yang dicoba udalah 20 pg/ml urin untuk anritriptilin dan nortriptilin, dan 40 gg/ml urin untLrk imiprarnin. tlasil yang diperoleh dapat dilihat pada tabel l. Seperti terlihat pada tabel tersebLlt reprodusibilitas metodc anaiisis ini cukup baik dcngan koelisiur variasi sebesar 1.27 untuk imipramin dan 2,7'l untLrk nortriptilin. Senrenlara itu koefisien variasi untuk arrritnptilin relatif lebih besar, yaitu 5,27 .
Tabel 1 Penemuan kembali lrecoveryl amin trisiklik dan reprod usibjlitas penentuan kadar dalam urin.
| Persen penemuan kembali | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| No. | lmipramin | Nortriptilin | Amitriptilin | ||
| I | 88,64 | 108,6 | 70,o7 | ||
| 2 | 88.64 | 111 ,3 | 7 6,67 | ||
| 3 | 88,64 | 1053 | |||
| 4 | 90.91 | 1 13,9 | 7 4 ,19 | ||
| 5 | 88.64 | 't08.6 | 70,89 | ||
| 88,64 | 107,2 | 75,44 | |||
| 7 | 88,64 | I t z,0 | 75,O2 | ||
| I | 90.9 r | 107,2 | 82,44 | ||
| Rata-rata | 82,2 | 109,4 | 7 4,7 | ||
| S. D. | 1,05 | 2,88 | 3,89 | ||
| Koef. var. | 1 ,20/o | 2,7% | 5,20A | ||
4.6 Kespesifikan metode
Dengan metode ini amitriptilin dapat ditentukan kadarnya meskipun tercampur dengan salah satu metabolit utamanya (nortriptilin) karena amitriptilin terpisah sempurna pada waktu krontatografi. Selain itu, perfenazin yang rrerupakar.r salah satu zat psikotropik yang biasa dikombinasi dengan antidepresan trisiklik, tidak mengganggu penentuan kadar amitriptilin dengan mctode analisis ini. Kemungkinan adanya interferensi dari senyawa-senyawa metabolit antideprcsan trisiklik yang lain belum dapat dilakukan.
4.7 Peneropdn metode
Metode analisis ini telah diterapkan dalam penentuan kadar beberapa senyawa antidepresan amin trisiklik dalam sediaan tablet dan dalam sampel urin setelalt pemberian senyawa-senyawa tersebut (clalam bentuk tablet) pada sukarclawan schat.
4.7.1 Penentuan kadar tlai sediaan tablet
Pcncntuan kadar dari scdiaan tablet menunjukkan hasil yang baik (tabel 2). Kadar scnyawa antidepresan amin trisiklik dari masing-masing tablet yang diperiksa ada dalam ratlge yang diperbolehkan. Khusus pada penentuan tablet yang selain mcngandurrg amitriptilin mengandung juga perfenazin, terlilrat bahwa perfenazin tidak mengganggu pcnentuan kadar amitriptilin dengan metode analisis ini.
Tabel 2 Hasil penentuan kadar dari sediaan lablet
| Amitriprilin (25 ms)* | lmipramin (25 mg) | Nortriptilin (10 mg) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| No, | Kadal | Rata-rata | No. | Kadar | Rata-rata | No. | Kadar | Rata-rata |
| 1 | 24,87 24,97 25,26 | 25,OO | 1 | 26,28 26,46 26.46 | 26,37 | 'I | 8,96 9,10 9,03 | 9,03 |
| 23BO 24,48 24,48 | 24,48 | 26,11 26,46 26,46 | 2654 | 9,25 o 1 ? o t n | 9,1'6 | |||
| 26,O3 2 6,03 26.03 | 26,O3 | 26,9'1 27 ,23 26,91 | 27 p5 | 9,40 9,40 9,40 | 9,40 | |||
| 24,4'l 24,O8 | 24,25 | 4 | 25,94 25,95 | 25,94 | 4 | 10,95 10,82 | 10,89 | |
* Mengandung 2 mg perfenazin.
4.7.2 Penentuan kadar dai urin sukerelartan
Dalam penelitian ini obat diberikan dalam dosis trrnggal dan urin dikunrpulkan selama periode 0-8 jam sesudah pembcrian obat. Hasil yang diperoleh dapat dilihat pada tabel 3 yang menunjukkan bahwa senyawa antidepresan amin trisiklik yang dicoba termetabolisis secara ekstensif dalam tubuh. Untuk amitriptilin dan imipramin, dengan metode analisis ini senyawa utuhnya tidak terdeteksi lagi dalam urin, sedangkan unluk nortriptihn ntasih bisa terdeteksi tetapi dalam jumlah yang relatif kecil, yaitu sekitar 10% dari dosis yang diberikan. Oleh karena itu untuk amitriptilin dan imipramin, penentuan dalarn urin pt'makai obat sebaiknya diarahl<an pada penentuan metabolitnya. Kedua senyawa ini mengalami metxbolist.ne ekstensif di dalam tLrbuh.
Karena keterbatasan senyawr pcrnbanding yang tersedia dalant penelitian ini. behlnl ditentukan rne tabolitnya.
| Antidepresan | Oosis | Oitemukan kembali |
|---|---|---|
| Amitriptilin | 25 mg | T. T . |
| lmipramin | 25 mg | T, T. |
| Nortriptilin | i0 m g | 1 .05 mg |
Tabel 3 Hasil penenluan senyawa amin trisiklik utuh dalam urin sukarelawan yang meminum obat dalam dosis tunggal.
fustaka
- Amundson M. E. & J. A. Manthey, Excretion of Nortriptyline hydrochloridein Man 1,J. Plnrm..lci.. 1966.J,5 (3),277-280. l .
- Pushkar, N. K., Quantitative Deternrination of Amitriptyline in Bloo<1, J. Pharm. ,Sci., 1978,67.(l)60 62. 2.
- Howard B. H. & C. S. Susan. G. L. C Method for Quantitative Determination of Amitriptyline in Human Plasnra, I Pharm. Sci., 1974,63. (2\.296-297.
- Garland W. A.. Quantitativs Determination of Amitriptyline and Its Principal Metabolite, Nortriptyline, by G. L. C-Chenrical lonization Mass Spectrornetry, "/. Phann. Sci., 1977,66, (l),77-81. A
- Burke, D. & H. Sokoloff, Sinrultaneous lligh Performance Liquid Chrornatographic Determination of Chlordiazepoxide and Amitriptylille hydrochloride in Two Component Tablet Formulations, J. Pharm. Sci.. 198O,69, (2), r38-140 5.
' T. T- = tidak rerderersi
- Buttedield, A. C. & R. W. Sears, High Perforrnance Liquid Chromatographic Determin.rtion of Perphenazine and Amitriptytine Hydrochloride in Two Component Tablet Fonnulations, J. Pharm. Sci., 1977,66,(8), lllT ll19. 6 .
- Raymond, F. S. & B. C. Thomas., Simultaneous Determination of Imiprame, Desipramine and their 2-Hydroxy Metabolites in Plasma by Ionpair Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography with Amperonretric Detection, ./. Pharnt. Sci., 1981, 70, (3),257 -)61 . 7.
- Frei, R. W. e t al, Liguid Chromatography of Dansyl Derivatives of some Alkoloids and the Application to thc Analysis of Pharmaceuticals, J. (lhromatogr., 1976, I16,365 377. 8.
- Reece. P. A. & Z. Rudi, Quantification of Imipramine and Desipranrine in Plasma by High Pcrforniance Liquid Chromatography and Fluorescence Detection, J. Chromatosr.. 1979. 1 63.310-314. 9.