Effects of preimplantation treatments of rubratoxin B on the development of preimplantation embryos and fetuses of Swiss Webster mouse (Mus musculus)

Rubratoxin B is a secondary metabolite of Penicillium rubrum and Penicillium purpurogenum, which moulds are often contaminating cereals, particularly food and feed. Single dosages of rubratoxin B 0.8 and 0.9 mg/kg body weight were administered intraperitoneally to Swiss Webster mice on day 0 or day 2 of gestation (preimplantation stage). Control mice were given propylene glycol only as rubratoxin B solvent. The effects of those treatments on preimplantation embryos were observed on gestation day 3.5, whereas those on fetuses were observed on day 18 of gestation. The results revealed that the development of preimplantation embryos was inhibited, shown by the decreased number of late blastocysts and the presence of earlier developmental stages. In the postimplantation stage these occurred: reduction in the number of implantation sites and live fetuses, increased intrauterine death, and cleft palate in the fetuses. In general, the results of the parameters obtained differed significantly compared to the controls and were dose related. In the treatment on gestation day 0, most of the preimplantation developmental delays occurred at earlier stages, i.e. 1-8 cells stage and uncompacted morulae, whereas in the groups treated on gestation day 2 inhibition shifted to older stages, predominantly at compacted morulae. It is concluded that preimplantation treatments of rubratoxin B inhibit the preimplantation development of the embryos, and consequently decrease the number of implantation sites, as well as the number of live fetuses, and is able to induce fetal malformation.

Key words: effects of rubratoxin B; embryos; fetuses; malformation; mouse; preimplantation treatment

1 Pendahuluan

Rubratoksin B adalah suatu mikotoksin yang merupakan metabolit sekunder dari Penicillium rubrum dan Penicillium purpurogenum. Kedua jenis kapang ini acapkali tumbuh dan mencemari biji-bijian dan serealia, yang merupakan bahan makanan dan pakan ternak, misalnya jagung, kacang, biji bunga matahari, gandum, dan beras, yang tersimpan dalam ruangan berkelembaban tinggi. Selain terdapat di alam, rubratoksin B dapat diproduksi di laboratorium bila kedua jenis kapang itu dikultur pada suhu 25°C selama tiga minggu, dalam

medium khusus yang mengandung gandum serta ragi, dan selanjutnya diisolasi [3].

Efek rubratoksin B terhadap hewan, terutama unggas dan ternak, telah banyak dilaporkan. Pemberian pakan yang terkontaminasi oleh P. rubrum kepada unggas, tcrnak, babi, kuda, dan mcncit terbukti rnenimbulkan berbagai cfek patologis, tcrulama berupa kerusakan hati dan ginjal [0]. Perlakuan serupa pada kuda menyebabkan perdarahan lambung dan usus halus, kentsakan jaringan otak, scrta in koordinasi sistcrn saraf p usat [22].

Terhadap hcwan pcrcobaan, rubratoksin B dapat rnernunculkan efck tcratogenik bentpa berbagai rnalforrnasi pada fetus. Kcrnunculan malforrnasi itu tcrgantung pada bcsarnya dosis rubratoksin B yang dibcrikan dan urnur kcbuntingan induk saat mendapat perlakuan. Beberapa kclainan yang sering didapat bila rubratoksin B diberikan pada lahap organogenesis ialah cksensefali, kclainan pina, kelainan rahang, hernia unrbilikalis (ornfalosel). dan rnata lcrbuka 15,l,201.

Rubratoksin B mcrupakan cmbriosida yang cfeknya lebih parah bila dibcrikan pada awal kcbuntingan, dibandingkan dengan pada umur kebuntingan yang lebih lanjut [7,20]. Pcmbcrian rubratoksin B pada umur kebuntingan awal juga menirnbulkan kelainan rangka yang sangat nyata pada fctus mcncit [20].

Etek pcrlakuan nrbra(lksin B pada tahap organogenesi.s tcrhadap pcrkcmbangan pralahir tclah banyak dilaporkan. bahkan pcngaruhnya tcrhadap pcrkembangan pascalahir atau pcrilaku pun sudah ditcliti [191. Hasilnya rnenunjukkan adanya bcrbagai kelainan ekstcrnal, internal, rangka, dan penyimpangan pcrilaku. Scjauh ini belum ada laporan mengcnai pengaruh perlakuan rubratoksin B pada tahap praimplantasi terhadap perkembangan cmbrio praimplantasi dan fetus.

Russel dan Russel tl3l menyatakan bahwa suatu teratogen yang bekcrja pada enrbrio tahap praimplantasi (zigot, pembelahan, blastososista) atau tahap praorganogencsis akan rnenyebabkan embrio itu mati atau tumbuh nonnal (hukum all or nothing), tergantung pada dcrajat kemsakan yang dialaminya. Namun, beberapa teratogcn seperti siklofosfamida [8], akrilamida I l], etilnitrosourea [l2], dan adriamisin F4l dapat menimbulkan kelainan pcrkembangan pada fetus bila diberikan pada tahap praimplantasi. Oleh karena itu, perlu dilakukan pcnelitian mengenai elek rubratoksin B, yang diberikan pada tahap praimplantasi, terhadap perkcmbangan embrio prairnplantasi tennasuk jumlah sel penlusun blastosista, terhadap penampilan reproduksi induk, serta kemunculan kelainan perkembangan pada letus.

2 Bahan dan cara kerja

2,1 Bahan

Hewan percobaan yang digunakan ialah mencit Swiss Wcbster yang diperoleh dari Jurusan Farmasi-ITB.

Pemeliharaan dilakukan di Rumah Hewan Jurusan BiologiJTB, dalam ruangan yang diberi penerangan listrik selarna 12 jam (pukul 06.00 - 18.00). Suhu ruangan rata-rata selama pemeliharaan ialah minirnum 22,86" C dan maksimum 26,83o C, dan ratarata kelembaban relatif 8.1,78 Vo. Pakan butiran (CP55l, PT Charoen Pokphand Indonesia) dan air minum berupa air ledeng diberikan secara ad libinmu

Bahan yang diuji adalah rubratoksin B produksi Makor Chemical Ltd.. Jenrsalcm.

2.2 Cara kerja

Mencit betina dcwasa dara (umur 8-10 minggu), dengan berat badan 25-30 gram, pada saat estrus dikawinkan (l:l) dengan rncncit jantan umur 12-1.1 minggu pada sore hari. Kccsokan paginya mencit yang bersumbat vagina dinyatakan bunting 0 hari. Sclanjutnya, mencit bunting dikelompokkan menjadi kelompok kontrol dan kelornpok pcrlakuan.

Pada umur kcbuntingan 0 atau 2 hari, mcncit perlakuan disuntik secara intraperitoneal dengan rubratoksin B yang dilarutkan dalarn propilen glikol dalam akuabidestilata (l:l v/v). Dosis yang diberikan adalah dosis tunggal 0,8 dan 0,9 mg/kg berat badarr (b.b.) dcngan volumc penyuntikan 0, lml/10 g b.b. Pada umur kebuntingan yang sama dengan kelompok pcrlakuan, mencit kontrol dibcri pelarut rubratoksin B dengan volumc dan cara pcnyuntikan yang sarna.

Penelitian tcrdiri ata,s dua percobaan:

• I Untuk melihat cfek 'rubratoksin B terhadap perkernbangan ernbrio prairnplantasi dan jumlah sel penyusun blastosista akhir.
  • Induk mencit dibunuh dengan cara dislokasi lcher pada umur kebuntingan 3,5 hari. Utcrus, oviduk, dan ovarium dikeluarkan dari rongga abdomen. Setelah dipisahkan dari ovarium, uterus dan oviduk dibilas (flushed) dengan lamtan Hanks menggunakan jarum ukuran 30 G yang ditumpulkan dan dipasang pada syringe tuberkulin. Ovarium diamati untuk penghitungan korpus luteurn. Selanjutnya, embrio yang diperoleh dikelompokkan rnenurut Setiorini €t al. |71dengan beberapa modifikasi, yaitu:
  • a embrio yang mengalami kelambatan perkembangan atau belum mencapai tahap blastosista akhir (1-8 sel); morula tidak marnpat; blastosista awal; dan bla.stosista sedang),
  • b embrio tahap blastosista akhir, dan
  • c embrio yang mengalami kelainan perkembangan (abnormal). Selanjutnya, terhadap blastosista akhir dilahrkan metode pewamaan krornosom menurut Tarkowski tzl) dengan beberapa modifika.si, unfuk penghitungan jumlah sel penyusunnya.

2 Untuk mengetahui penampilan rcproduksi induk dan kelainan perkembangan pada fetus.

Induk mencit dibunuh pada umur kebuntingan 18 hari, kemudian dilakukan pengamatan dan analisis terhadap jumlah implantasi, kchilangan praimplantasi, jumlah fetus hidup, kematian intrauterus (fetus mati dan embrio yang diresorpsi), dan berat badan fetus. Fcfus yang mengalami kelainan perkembangan dan jenis kclainan yang muncul diarnati dan dianalisis pula .

Analisis data parametrik dilakukan dengan uji sidik ragarn yang dilanjutkan clcngan uji beda nyala terkccil (BNT). Data noupararnetrik dirrji dcngan Wilcoxon's rank surn tcst. Dcrajat signifikansi ditcntukan pada p<0,05 (nyata) dan p<0,01 (sangat nyata). Data dianalisis atas dasar unit anakan (litter unit), yang berarti bahwa semua nilai purata yang dicanturnkan dalam hasil pengarnatan atlalah purata dari purata tiap anakan (mcan of thc littcr rncan).

3 llasil dan pembahasan

Dari Tabel I dapat dibaca bahwa rutrratoksin B dosis 0,8 dan 0,9 rng/kg b.b. yang dibcrikan sccara infraperitoncal pada tahap prairnplantasi urnur kcbuntingan 0 atau 2 hari telah mengharrrbat dan mcryebabkan kelainan perkcrnbangan ernbrio prairnplanlasi. l-larntlatan pcrkcrnbangan ditandai dengan bcrkurangnya jumlah ernbrio yang berhasil nrcncapai tahap blastosista akhir, schingga masih tcrdapat cnrbrio tahap l-8 sel, morula tidak manlpat, morula rnarnpat, blastosisla awal, dan blastosista scdang. Pada urnrrr 3,5 hari, sehamsnya sebagian besar dari crnbrio sudah rncncapai tahap

blastosista akhir [16]. Pada pcnclitian ini sekitar 507o atau lebih embrio kontrol telah berada di tahap blastosista akhir, scdangkan embrio pedakuan hanya ll,97Va - 29,351o. Persentasc blastosista akhir menumn secara sangat nyata dari kontrol pada semua kelompok perlakuan, terutama pada kclornpok pedakuan umur kebuntingan 2 hari dengan dosis 0,9 mg/kg b.b., serta sejalan dengan besarnya dosis mbratoksin B yang diberikan, untnk semua kclornpok perlaliuan.

Embrio tahap l-8 scl ditcrnrrkan pada pcrlakuan umur kebuntingan 0 hari dcngan riosis 0,8 rng/kg b.b. dan perscntasc kcberadaannya sangat nyala dari kontrol. Pada kelompok ktlnl.rol sudah tidak ada lagi cmbrio tahap l-8 scl, dcmikian pula pada scrnua kelorrrpok pcrlakuan lainnya.

Morula tidak rnanrpat masih tcrdapat. sccara sangat nyata harnpir pada scmua kclornpclk pcrlakuan, terutama pada pcrlakuan urnur kcbuntingan 0 hari. Patla pcrlakuan umur kcbuntingan 2 hari, crnbrio tahap ini hanya terdapat pada dosis tcrtinggi saja. llarnbatan yang tcrjadi pada tahap momla mampat llaling banyak dan sangat nyata didapat pada pedakuan umur kebuntingan 2 hu| sedangkan pada pedakuan umur kcbuntingan 0 hari, rncskipun pada dosis 0,8 mg/kg b.b. sccara nyata lebih tinggi dari kontrol, namun kcrnunculannya rcndah scperti juga halnya pada kontrol" Hai ini terjadi karcna pada saat perlakuan tli umur kcbuntirrgan 0 hari, cmbrio rnasih bcrada pada tahap satu sel, sedangkan pada rrmur kebuntingan 2 hari sudah rnocapai lahap 8-16 scl atau tahap momla tl6l. Olch karena itu, hambatan perkcrnbangan pada pcrl:*uan umur 2 hari tcrjadi pada tahap yang lebih tua daripada bila pcrlakuan dibcrikan pada umur kcbuntingan 0 hari.

Tabel 1 Keadaan perkembangan embrio praimplantasi yang diamati pada umur kebunlingan 3,5 hari dari induk moncit yang diberi perlakuan rubraloksin B pada umur kebuntingan nol atau dua hari

^&#x27;:berbedanyatadarikontrolpadap<0,05":berbedasangatnyatadarikonlrolpadap<Q,A1(Wilcoxonbranksumtesg

Persentase blastosista awal dan blastosista sedang pada kelompok perlakuan, terutama pada perlakuan umur kebuntingan 2 hari dosis 0,9 mg/kg b.b. (3,42% blastosista awal dan 4,27% blastosista sedang), umumnya lebih rendah dan berbeda nyata hingga sangat nyata dari kontrol (12,5% sampai 24,79%). Lebih rendahnya persentase ini disebabkan oleh banyaknya embrio yang perkembangannya terhambat pada tahaptahap sebelumnya, terutama pada tahap morula mampat.

Pola hambatan perkembangan pada perlakuan umur kebuntingan 0 hari atau 2 hari, dan terjadinya pergeseran hambatan ke arah tahap perkembangan yang lebih tua pada perlakuan umur kebuntingan 2 hari, ditunjukkan pada Gambar 1, yaitu pada perlakuan dosis 0,8 mg/kg b.b. Pola hambatan perkembangan yang didapat sesuai dengan hasil pengamatan beberapa peneliti terdahulu yang menggunakan teratogen yang lain pada mencit Kud; ddy dan ICR [6,13,17].

Keterangan: Perkembangan embrio tahap:

• 1:1-8 set
• 2: Morula tidak mampat
• 3: Morula mampat
• 4 : Blastosista awal
• 5 : Blastosista sedang
• 6 : Blastosista akhir

Pola hambatan perkembangan embrio praimplantasi Cambarakuan rubratoksin (b) dosis tunggal 0,8 mg/kg b.b. yang diberikan secara intraperitoneal pada mencit umur kebuntingan 0 hari (a) dan 2 hari (b) serta pergeseran hambatan ke tahap perkembangan yang lebih tua pada perlakuan umur kebuntingan 2 hari (b)

Selain menghambat perkembangan embrio praimplantasi, rubratoksin B juga mengakibatkan terdapatnya embrio abnormal, yang pada kelompok kontrol tidak pernah muncul. Embrio abnormal yang paling banyak ditemukan dan kejadiannya sangat nyata adalah embrio yang berdegenerasi, pada perlakuan dengan dosis tertinggi yang diberikan pada umur kebuntingan 0 hari dan terutama pada perlakuan umur kebuntingan 2 hari. Perlakuan dengan dosis 0,9 mg/kg b.b. memunculkan 31,36% embrio abnormal pada umur kebuntingan 0 hari, dan 50,43% pada perlakuan umur kebuntingan 2 hari. Selain itu, ditemukan pula embrio tanpa zona pelusida yang menyebar pada semua kelompok perlakuan, dan pada umumnya sangat nyata lebih banyak dari kontrol. Terdapatnya zona pelusida tanpa embrio, yang muncul hanya pada perlakuan umur kebuntingan 0 hari dengan dosis 0,8 mg/kg b.b., tidak dianggap sebagai kelainan, melainkan sebagai embrio yang terlalu cepat menetas. Hal ini berbeda dengan laporan penelitian Setiorini et al. [17] yang menganggap zona pelusida tanpa embrio sebagai suatu kelainan. Embrio abnormal yang didapat dalam penelitian ini serupa dengan hasil yang dilaporkan oleh sejumlah peneliti terdahulu yang menggunakan teratogen yang berbeda dan mencit galur lain [1,6].

Meningkatnya persentase embrio yang terhambat dan abnormal perkembangannya dapat secara langsung disebabkan oleh rubratoksin B yang masuk ke dalam cairan di dalam rongga uterus atau oviduk, melalui sekret kelenjar, lalu masuk ke dalam blastosista. Hal ini didasarkan pada laporan Kulangara & Crutchfield [8] yang menyatakan bahwa ion dan molekul kecil yang disuntikkan kepada induk mencit bunting ternyata dapat ditemukan di dalam rongga oviduk, uterus, dan cairan blastosista. Bahkan, molekul besar seperti protein pun, yang diberikan kepada induk, dapat ditemukan pada embrio mencit di oviduk dan di dalam blastosista kelinci. karena nutrisi embrio tahap praimplantasi bergantung pada sekret kelenjar oviduk dan uterus, maka perkembangan embrio dapat terganggu oleh adanya rubratoksin B di dalam bahan nutrisi embrio itu. Selain itu, menurut Fabro & Sieber [15] senyawa dengan berat molekul 17000 dapat masuk ke dalam blastosista, sehingga rubratoksin B yang memiliki berat molekul 518 sangat besar kemungkinannya dapat masuk ke dalam blastosista yang antara lain akan menghambat pembelahan sel embrio. Hambatan perkembangan itu dapat juga merupakan akibat tidak langsung dari rubratoksin B karena adanya gangguan fisiologis induk, sebab rubratoksin B dilaporkan juga dapat merusak hati dan ginjal, serta dapat mengganggu siklus Krebs di dalam tubuh dan juga mengakibatkan disagregasi polisom [3,4].

Hasil penghitungan jumlah sel yang menyusun blastosista akhir menunjukkan penurunan secara nyata dari kontrol pada semua kelompok perlakuan dan juga antarperlakuan, serta sejalan dengan besarnya dosis yang diberikan (Tabel 2). Pada Gambar 2 tampak bahwa

Tabel 2 Jumlah sel yang menyusun blastosista akhir pada perlakuan rubratoksin B umur kebuntingan nol atau dua hari yang diamati pada umur kebuntingan 3,5 hari

Angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji BNT (Beda Nyata Terkecil) pada p < 0,05

Gambar 2 Pengaruh rubratoksin B dosis tunggal 0,8 atau 0,9 mg/kg b.b. yang diberikan secara intraperitoneal pada mencit umur kebuntingan nol atau dua hari terhadap jumlah sel yang menyusun blastosista akhir.

hambatan terhadap jumlah sel tersebut lebih parah bila rubratoksin B diberikan pada umur kebuntingan 0 hari. Penurunan jumlah sel penyusun blastosista akhir dilaporkan pula pada perlakuan dengan sikofosfamida [18], metilmerkuriklorida dan merkuriklorida [6], serta mitomisin C [3] yang diberikan pada tahap praimplantasi. Penurunan jumlah sel ini disebabkan oleh terhambatnya pembelahan sel, yang antara lain diakibatkan oleh terhambatnya inisiasi translasi mRNA oleh rubratoksin B untuk menghasilkan protein tubulin. Protein tubulin merupakan komponen mikrotubul yang berperan dalam proses pembelahan sel [2,23]. Terhambatnya proses translasi dapat juga disebabkan oleh rubratoksin B yang menyebabkan disagregasi polisom [24].

Terhadap perkembangan pascaimplantasi, ternyata rubratoksin B yang diberikan pada tahap praimplantasi dapat menurunkan jumlah fetus hidup pada semua kelompok perlakuan secara sangat nyata. Demikian pula halnya dengan meningkatnya kematian intrauterus, terutama berupa embrio yang diresorbsi, yang kejadiannya sangat nyata hampir pada semua kelompok perlakuan (Tabel 3). Jumlah implantasi menurun secara nyata pada perlakuan umur kebuntingan 0 hari dan menjadi sangat nyata pada perlakuan umur kebuntingan 2 hari. Menurunnya jumlah implantasi oleh rubratoksin

B dapat dikaitkan dengan kerja rubratoksin B terhadap perkembangan embrio praimplantasi, yakni menurunkan jumlah blastosista akhir. Untuk dapat berimplantasi, embrio harus mampu mencapai tahap blastosista akhir. Oleh karena itu, berkurangnya embrio yang berhasil mencapai tahap tersebut akan menyebabkan menurunnya jumlah implantasi. Kehilangan praimplantasi juga meningkat sangat nyata pada semua kelompok perlakuan, terutama pada perlakuan umur kebuntingan 2 hari, disebabkan oleh banyaknya embrio yang terhambat perkembangannya pada tahap praimplantasi dan juga oleh meningkatnya jumlah embrio yang abnormal. Secara umum, dibandingkan dengan kontrol, semua efek rubratoksin B terhadap penampilan reproduksi induk dan perkembangan pascaimplantasi memperlihatkan kejadian yang sejalan dengan peningkatan dosis yang diberikan.

Berbeda dengan pernyataan Russel & Russel [13] yang mengemukakan hukum all or nothing, ternyata perlakuan dengan rubratoksin B pada tahap praimplantasi dapat memunculkan kelainan perkembangan pada fetus umur 18 hari. Kelainan perkembangan yang muncul ialah club foot dan langit-langit bercelah (Tabel 4). Langit-langit bercelah muncul, baik pada kelompok perlakuan umur kebuntingan 0 hari maupun 2 hari, tetapi hanya pada perlakuan dengan dosis tertinggi saja, dan kemunculannya sangat nyata pada perlakuan umur kebuntingan 2 hari. Kelainan ini tidak didapat pada kelompok kontrol. Kemunculan club foot tidak memperlihatkan perbedaan yang nyata dari kontrol, meskipun pada perlakuan umur kebuntingan 2 hari kejadiannya cenderung meningkat dan sejalan dengan besarnya dosis rubratoksin B yang diberikan. Dalam penelitian ini, club foot, seperti juga perdarahan, mungkin muncul secara spontan sebab kejadiannya rendah dan tidak selalu sejalan dengan besarnya dosis, serta ditemukan pula pada kelompok kontrol.

Penelitian dengan rubratoksin B ini mendukung hasil penelitian Nagao et al. [13,14], bahwa perlakuan dengan teratogen pada tahap praimplantasi masih dapat memunculkan kelainan perkembangan pada fetus, meskipun teratogen yang digunakannya berbeda.

^&#x27;:berbedanyatadarikontrolpadap<0,05,":berbedasangalnyaladarlkonlrolpadap<0,01(@:Ulit-Sludenl,a:Wilcoxonsrank surn lesl), # : kelainan p€rk€mbangan berupa langll-langil b€rcslah dan club fool

Tabel 4 Kelainan p€rk€mbangan dan perdarahan pada felus menclt umur kebuntingan 18 hari yang induknya diberi perlakuan rubraloksin B pada umur kebunlingan nol atau dua hari

^&quot; : berbeda sangal nyala dari konlrol pada p < O,O1 (Wilcoxon's ranK sum test'l

4 Kesimpulan

Rubratoksin B yang diberikan secara intraperitoneal pada tahap praimplantasi mencit (Mus musculus) Swiss Webster umur kebuntingan 0 hari alau 2 harr, dengan dosis tunggal 0,8 atau 0,9 mg/kg b.b., menyebabkan hambatan dan kelainan perkembangan embrio praimplantasi, serta berkurangnya jumlah sel yang menyusun blastosista akhir. Terhadap perkembangan pascaimplantasi, rubratoksin B memrrunkan jurnlah implanta.si dan jumlah fetus hidup, meningkatkan kematian inFauterus, serta dapat memunculkan kelainan perkembangan pada fefus.

5 Ucapan terima kasih

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Departemen Pendidikan dan Kebudayaan RI atas bantuan biaya dari Proyek URGE untuk pelaksanaan penelitian ini.

6 Daftar pustaka

• Darmanto, W., Kabir, N., Inouye, M., Takagishi, Y. & Yamamura, H. Effects of 2-methoxyethanol and methoxyacetic acid on preimplantation mouse embryos in vitro. Environ. Med., 38, 33-36 (1994).
• Desaiah, D., Hayes, A.W. & Ho, I.K. Effect of rubratoxin B on adenosine triphosphatase activities in the mouse. Toxicol. Appl. Pharmacol., 39, 71-79. (1977).
• 3. Hayes, A.W. 1977. Rubratoxins. In Mycotoxin in human and animal health (V.J. Rodrick., C.W. Hesseltine & M.A. Mehlmen, editors), Pathotox Publ., Park Forest South, 505-523 (1977).
• 4. Hayes, A.W. & Hannan, C.J. Effect of rubratoxin B and aflatoxin on oxygen consumption of Krebs cycle intermediates. Toxicol. Appl. Pharmacol., 25, 30-41 (1973).
• Hood, R.D., Ines, J.E. & Hayes, A.W. Effects of rubratoxin B on prenatal development in mice. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 10, 200-207 (1973).
• 6. Kajiwara, Y. & Inouye, M. Effects of methylmercury and mercuric chloride on preimplantation mouse embryos in vivo. Teratology, 33, 231-237 (1986).
• Koshakji, R.P., Wilson, B.J. & Harbison, R.D. Effect of rubratoxin B on prenatal growth and development in mice. Res. Comm. Pathol. Pharmacol., 5, 584-592 (1973).
• 8. Kulangara, A.C. & Crutchfield, F.L. Passage of bovine serum albumin from the mother to rabbit blastocysts. J. Embryol. Exp. Morph., 30, 471-482 (1973).
• Matsumoto, N., Spindle, A., Katayama, S. & Kabo, H. Culture and transfer of embryos as testing system for embryotoxicity of chemicals. Cong. Anom., 24, 353-372 (1984)
• 10. Moss, M.O. The rubratoxins, toxic metabolites of Penicillium rubrum Stoll. In Microbial toxins Part VI: Fungal toxin (G. Kadis, editor). Academic Press, New York, 392-407 (1971).
• 11. Nagao, T. Developmental abnormalities due to exposure of mouse paternal germ cell, preimplantation embryos and organogenetic embryos to acrylamide. Cong. Anom., 34, 35-46 (1994).

• 12. Nagao, T. Exposure of ethylnitrosourea before implantation induced congenital malformation in mouse fetuses. Cong. Anom., 36, 83-94 (1996).
• 13. Nagao, T., Ishuzuka, Y. & Mitzutani, M. Effects of mitomycin C treatment before implantation on the development of mouse embryos. Cong. Anom., 26, 93-101 (1986).
• Nagao, T., Shiota, M. & Sato, M. Treatment of preimplantation mouse embryos with adriamycin, methylmethanesulphonate, and retinoic acid induced congenital defect. Cong. Anom., 37, 21-29 (1997).
• Nishimura, H. & Tanimura, T. Clinical aspects of the teratogenicity of drugs. American Elsevier Publ. Co. Inc. New York, (1976).
• Rugh, R. The mouse. Its reproduction and development. Burgess Publishing Co., Minneapolis. U.S.A. 44-102 (1968).
• 17. Setiorini, R., Inouye, M. & Oda, S. Effects of zinc chloride, mercuric chloride, and cadmium chloride on preimplantation mouse embryos in vivo. Environ. Med., 35, 135-138 (1991).
• 18. Spielmann, H., Eibs, H.G. & Merker, H.J. Effects of cyclophosphamide treatment before implantation on the development of rat embryos after implantation. J.Embryol. Exp. Morph., 41, 65-78 (1977).
• Surjono, T.W., Kihara, T. & Tanimura, T. Effects of prenatal rubratoxin B exposure on behaviour and function in postnatal mice. (Abstract). Cong. Anom., 28 (3), 231-232 (1988).
• Surjono, T.W., Syarif, T., Sudarwati, S. & Okada, K. Sensitive period for rubratoxin B induced malformation in ICR mice. Cong Anom., 297-304 (1985).
• 21. Tarkowski, A.K. An air drying method for chromosome preparation from mouse eggs. Cytogenetic, 5, 394-400 (1966).
• Wyllie, T.D. & Morehouse, L.G. Mycotoxic fungi, mycotoxins, mycotoxicoses. Vol.1. Marcel Dekker Inc., New York, (1977).
• 23. Watson, S.A. & Hayes, A.W. Binding of rubratoxin B to mouse hepatic microsomes and in vitro effects of the mycotoxin on polysome binding to microsomal membranes as measured by the activity of an enzyme catalyzing disulphide interchange. Toxicon, 19, 509-516 (1981).
• 24. Watson, S.A. & Hayes, A.W. Effects of alteration in metabolism on rubratoxin B toxicity in vitro and in the isolated rat parenchymal cell. Toxicol. Appl. Pharmacol., 64, 504-516 (1982).